所有的生物芯片技術(shù)都包含四個基本要點：芯片的制作、雜交或反應(yīng)、測定或掃描、數(shù)據(jù)處理。生物芯片的技術(shù)核心是芯片的制備及反應(yīng)信號的檢測。

1、芯片制備技術(shù)
目前制備芯片的方法基本上可分為兩大類：一類是原位合成(in situ Synthesis)；一類是合成后交聯(lián)(post-synthesis attachment)。原位合成是目前制造高密度寡核苷酸芯片最為成功的方法。在制備基因芯片時要考慮陣列的密度、再生性、操作的簡便性、成本的高低等幾方面的因素。
具體而言，比較典型的DNA芯片制備方法有4種：第一種方法是Affymetrix公司開發(fā)的光引導(dǎo)原位合成法，該方法是微加工技術(shù)中光刻工藝與光化學(xué)合成法相結(jié)合的產(chǎn)物。第二種方法是Incyte Pharmaceutical公司采用的化學(xué)噴射法，該方法是將合成好的核昔酸探針定點噴射到芯片上并加以固定化來制作DNA芯片。第三種方法是斯坦福大學(xué)研制的接觸式點涂法。在DNA芯片制備中通過高速精密機械手的精確移動讓移液頭與玻璃芯片接觸，而將DNA探針涂敷在芯片上。第四種方法是通過使用4支分別裝有A，T，G，C核昔的壓電噴頭在芯片上并行地合成出DNA探針。

光引導(dǎo)合成法與噴墨打印法、合成點樣法相比，最大的優(yōu)點是，它可以合成密度極高的陣列；但它的最大缺點是耗時、操作復(fù)雜，而且為保證在不同位點加上不同的單體，從而在不同的位點合成不同的探針，需要不斷更換不同的蔽光膜，對一個含25個堿基的探針的微陣列，一般需更換100個蔽光膜，需一天多的時間才能完成。合成點樣法雖然芯片上探針的密度相對較低，每個樣品都要預(yù)合成、純化，在芯片制備前還需妥善保存合成的探針，但是它的最大優(yōu)點是操作簡便。目前很多公司采用這種方法來制備芯片。

2、樣品制備技術(shù)
生物樣品往往是各種組分的混合體，成分非常復(fù)雜，由于目前的檢測體系還不能檢測出未擴增的標(biāo)記樣品，所以待測樣品DNA在雜交前一般都要進行聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)，在擴增的過程中，對靶DNA進行標(biāo)記。目前DNA樣品的擴增一般是通過液相反應(yīng)來完成，但由于低濃度核酸很難檢測到，在溶液中通過PCR反應(yīng)獲得線性擴增也很困難；另外，不同靶DNA對引物的競爭，意味著某一序列的擴增優(yōu)于其他序列。為了解決上述問題，一些公司正在研究新的方法。如固相PCR系統(tǒng)，該系統(tǒng)是將2種引物排列在丙烯酰胺膜上，與DNA樣品、PCR試劑混合，如樣品含有靶序列，則開始擴增反應(yīng)；通過這種固相PCR體系，可避免對引物的競爭，同時也降低了遺留污染。不過也有不少人試圖繞過樣品擴增這一問題，如 Mosaic Technologies 公司引入的固相 PCR 方法，引物特異性強，無交叉污染并且省去了液相處理的煩瑣； Lynx Therapeutics 公司引入的大規(guī)模并行固相克隆法 (Massively parallel solid-phase cloning) ，可在一個樣品中同時對數(shù)以萬計的 DNA 片段進行克隆，且無需單獨處理和分離每個克隆。
在芯片飛速發(fā)展的今天，樣品制備已經(jīng)成為芯片發(fā)展的瓶頸所在。對于較大規(guī)模制作芯片的用戶，由于點樣樣品數(shù)目太多，即使采用高通量試劑盒還是不夠方便。世界上聲譽卓著的核酸純化供應(yīng)商德國QIAGEN公司推出了全自動核酸和蛋白純化工作站，該工作站有4個不同的自動純化系統(tǒng)型號：BioRobot 8000，BioRobot 3000，BioRobot 9604，BioRobot 9600，加上QIAGEN優(yōu)質(zhì)的多種配套純化試劑盒--從質(zhì)粒、粘粒、RNA、血液基因組DNA、病毒DNA到蛋白，品種豐富，在歐美的生物醫(yī)學(xué)市場上掀起了一場革命，各大分子生物學(xué)中心、芯片中心、醫(yī)學(xué)中心爭相搶購。
樣品獲得后要進行標(biāo)記，目前樣品的標(biāo)記主要是熒光標(biāo)記。熒光標(biāo)記基本分為2種，一種是使用熒光標(biāo)記的引物，一種是使用熒光標(biāo)記的三磷酸脫氧核糖核苷酸。目前常使用的熒光物質(zhì)有：熒光素、羅丹明、HEX、TMR、FAM、Cy3、Cy5等。根據(jù)擴增產(chǎn)物分離的方法不同，標(biāo)記的方法也不同：進行單引物標(biāo)記的，其擴增產(chǎn)物通常由聚丙烯酰胺凝膠電泳分離；對一個引物用生物素標(biāo)記，另一個引物用熒光素標(biāo)記的，一般用親合素偶聯(lián)的磁珠捕捉其擴增產(chǎn)物，通過變性處理使熒光標(biāo)記的產(chǎn)物解鏈。此外，也有用生物素殘基標(biāo)記引物，將生物素標(biāo)記的擴增產(chǎn)物與芯片雜交，洗滌后加入親合素連接的熒光物，通過生物素與親合素的結(jié)合及靶序列與探針的結(jié)合產(chǎn)生熒光信號，然后利用熒光檢測系統(tǒng)對熒光信號進行檢測。

3、芯片點樣技術(shù)
點樣法是將預(yù)先通過液相化學(xué)大量合成好的探針、或PCR技術(shù)擴增cDNA或基因組DNA經(jīng)純化、定量分析后，通過由陣列復(fù)制器（arraying and replicating device，ARD）或陣列點樣機（arrayer）及電腦控制的機器人，準(zhǔn)確、快速地將不同探針樣品定量點樣于帶正電荷的尼龍膜或硅片等相應(yīng)位置上（支持物應(yīng)事先進行特定處理，例如包被以帶正電荷的多聚賴酸或氨基硅烷），再由紫外線交聯(lián)固定后即得到DNA微陣列或芯片。
點樣的方式分兩種，其一為接觸式點樣，即點樣針直接與固相支持物表面接觸，將DNA樣品留在固相支持物上；其二為非接觸式點樣，即噴點，它是以壓電原理將DNA樣品通過毛細(xì)管直接噴至固相支持物表面。打印法的優(yōu)點是探針密度高，通常1平方厘米可打印2,500個探針；缺點是定量準(zhǔn)確性及重現(xiàn)性不好，打印針易堵塞且使用壽命有限。噴印法的優(yōu)點是定量準(zhǔn)確，重現(xiàn)性好，使用壽命長；缺點是噴印的斑點大，因此探針密度低，通常只有1平方厘米400點。點樣機器人有一套計算機控制三維移動裝置、多個打印/噴印頭、一個減震底座，上面可放內(nèi)盛探針的多孔板和多個芯片。根據(jù)需要還可以有溫度和濕度控制裝置、針洗滌裝置。打印/噴印針將探針從多孔板取出直接打印或噴印于芯片上。
現(xiàn)在已經(jīng)有比較成型的點樣裝置出售，例如美國Biodot公司的“噴印”儀，以及Cartesian Technologies公司的Pix-Sys NQ/PA系列“打印”儀。這些自動化儀器依據(jù)所配備的“打印”或“噴印”針將生物大分子從多孔板吸出直接“打印”或“噴印”于芯片片基上。“打印”時針頭與芯片片基表面發(fā)生接觸而“噴印”時針頭與片基表面保持一定的距離。所以，“打印”儀適宜制作較高密度的微陣列（例如2500點/cm2），“噴印”法由于“噴印”的斑點較大，所以只能形成較低密度的探針陣列，通常400點/cm2。點樣法制作芯片的工藝比較簡單便于掌握、分析設(shè)備易于獲取，適宜用戶按照自己的需要靈活機動地設(shè)計微點陣，用于科研和實踐工作。目前，除了在生物芯片研制方面享有盛譽的Affymetrix公司等個別公司使用原位合成技術(shù)制造芯片外，大多中小型公司普遍采用點樣技術(shù)制作生物芯片。

4、探針的制備技術(shù)
探針（探針的功能是識別靶序列和攜帶報告分子（如同位素、熒光、地高辛等））：為了提高監(jiān)測靈敏度，人們的努力放在信號放大以及模板擴增兩個方面，其中應(yīng)用經(jīng)過特殊處理的探針方法可以提高靈敏度的方法有三種：分支探針這種方法的原理是，設(shè)計具有龐大分支結(jié)構(gòu)的分支核苷酸探針，分支末端以酶標(biāo)記。這樣，經(jīng)過分支核苷酸與酶的雙重放大作用而將標(biāo)本雜交時極弱的信號轉(zhuǎn)換為較強的化學(xué)信號。）、分子信標(biāo)（Molecular beacon, MB，一種設(shè)計巧妙的熒光標(biāo)記的核酸探針，未雜交狀態(tài)下為發(fā)夾結(jié)構(gòu)，在發(fā)夾的兩端分別連接熒光素分子和猝滅分子，利用熒光共振能量轉(zhuǎn)移原理（FRET））、肽核酸（Peptide nucleic acids, PNA，以中性酰胺鍵為骨架，不帶電荷，為DNA類似物。與DNA的親和性高、酶解穩(wěn)定性好，因此多用來做診斷和檢測用探針）探針3項技術(shù)。

5、雜交反應(yīng)及過程控制技術(shù)
芯片雜交是DNA芯片技術(shù)中除DNA方陣構(gòu)建外最重要的一步。雜交時選擇的條件要使成千上萬對的雜交反應(yīng)中的最大多數(shù)處于最佳狀態(tài)中，也就是說要使得盡可能多的正確配對物都不遺漏（假陰性盡可能少），有錯配的雜交降低至最低（假陽性盡量少），這是非常難以達(dá)到的境界。
目前雜交是提高芯片在實際應(yīng)用中的準(zhǔn)確性的關(guān)鍵步驟之一。雜交條件的構(gòu)建要根據(jù)芯片的實際情況進行最優(yōu)化。
雜交反應(yīng)是一個復(fù)雜的過程，受很多因素的影響，而雜交反應(yīng)的質(zhì)量和效率直接關(guān)系到檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。這些影響因素包括：（1）寡核苷酸探針密度的影響。低覆蓋率使雜交信號減弱，而過高的覆蓋率會造成相鄰探針之間的雜交干擾。（2）支持介質(zhì)與雜交序列間的間隔序列長度的影響。研究表明當(dāng)間隔序列長度提高到15個寡核苷酸時雜交信號顯著增強。有研究表明，選擇合適長度的間隔序列，可使雜交信號增強150倍。（3）雜交序列長度的影響。在雜交反應(yīng)中經(jīng)常發(fā)生堿基錯配現(xiàn)象，區(qū)分正常配對的互補復(fù)合物與單個或2個堿基的錯配形成的復(fù)合物，主要依賴于形成的復(fù)合物的穩(wěn)定性不同，而雜交序列的長度是影響復(fù)合物穩(wěn)定性的一個重要因素，一般說來，短的雜交序列更容易區(qū)分堿基的錯配，但復(fù)合物的穩(wěn)定性要差一些；而長雜交序列形成的復(fù)合物穩(wěn)定，而區(qū)分堿基錯配能力要差一些。研究表明，12、15、20個堿基產(chǎn)生的雜交信號強度接近，但15個堿基的雜交序列區(qū)分錯配堿基效果最好。（4）GC含量的影響。GC含量不同的序列其復(fù)合物的穩(wěn)定性也不同。（5）探針濃度的影響。以凝膠為支持介質(zhì)的芯片，提高了寡核苷酸的濃度，在膠內(nèi)進行的雜交更象在液相中進行的雜交反應(yīng)，這些因素提高了對錯配堿基的分辨率，同時也提高了芯片檢測的靈敏度。（6）核酸二級結(jié)構(gòu)的影響。在使用凝膠作為支持介質(zhì)時，單鏈核酸越長，則樣品進入凝膠單元的時間越長，也就越容易形成鏈內(nèi)二級結(jié)構(gòu)從而影響其與芯片上探針的雜交，因而樣品制備過程中，對核酸的片段化處理，不僅可提高雜交信號的強度，還可提高雜交速度。

6、雜交圖譜的信號檢測技術(shù)
雜交圖譜的信號檢測是生物芯片的兩個關(guān)鍵技術(shù)之一，目前關(guān)于芯片的大量專利和研究集中在這方面。熒光檢測主要有2種：激光共聚焦熒光顯微掃描和CCD熒光顯微照相檢測。前者檢測靈敏度、分辨率均較高，但掃描時間長；后者掃描時間短，但靈敏度和分辨率不如前者。雖然熒光檢測在芯片技術(shù)中得到了廣泛的應(yīng)用，但是熒光標(biāo)記的靶DNA只要結(jié)合到芯片上就會產(chǎn)生熒光信號，而目前的檢測系統(tǒng)還不能區(qū)分來自某一位點的熒光信號是由正常配對產(chǎn)生的，還是單個或2個堿基的錯配產(chǎn)生的，或者兼而有之，甚或是由非特異性吸附產(chǎn)生的，因而目前的熒光檢測系統(tǒng)還有待于進一步完善與發(fā)展。有研究者正試圖繞過熒光標(biāo)記，建立新的檢測系統(tǒng)，以提高雜交信號檢測的靈敏度。
比較成熟的是采用激光系統(tǒng)掃描儀進行的熒光檢測，噪音水平、信噪比、分辨率是衡量掃描儀工作質(zhì)量的幾個重要指標(biāo)。由于熒光標(biāo)記法的靈敏度相對較低，因此質(zhì)譜法、化學(xué)發(fā)光和光導(dǎo)纖維、二極管方陣檢測、乳膠凝集反應(yīng)、直接電荷變化檢測等等正作為新的芯片標(biāo)記和檢測方法處于研究和試驗階段，其中最有前途的當(dāng)推質(zhì)譜法。
目前有很多廠商生產(chǎn)生物芯片信號檢測掃描儀，知名的公司包括：Genomic Solutions公司、Packard公司、GSI公司、Molecular Dynamics、Genetic âMicrosystems公司、Axon Instruments公司等。其中GSI Lumonics 公司ScanArray 系列一直是生物芯片掃描檢測系統(tǒng)中的領(lǐng)頭產(chǎn)品。2000年GSI并入著名的Parkard公司后ScanArray的軟、硬件都得到進一步加強。

7、信號（信息）分析與解讀——數(shù)據(jù)分析
芯片雜交圖譜的多態(tài)性處理與存儲都由專門設(shè)計的軟件來完成。一個完整的生物芯片配套軟件應(yīng)包括生物芯片掃描儀的硬件控制軟件、生物芯片的圖像處理團建、數(shù)據(jù)提?。╩ining）或統(tǒng)計分析軟件，芯片表達(dá)基因的國際互聯(lián)網(wǎng)上檢索和表達(dá)基因數(shù)據(jù)庫分析和積累。
從國際上生物芯片專利的按領(lǐng)域分布來看，62%的專利集中在數(shù)據(jù)分析領(lǐng)域，可見如何對生物芯片帶來的海量數(shù)據(jù)進行解讀、分析是生物芯片研究領(lǐng)域的焦點和重點。
對所讀取的數(shù)據(jù)的處理方面，目前已經(jīng)有許多數(shù)學(xué)統(tǒng)計的方法用于芯片數(shù)據(jù)處理與信息提取，應(yīng)用最廣泛的是聚類分析（cluster analysis）、此外還有主成分分析(principal component analysis)、時間序列分析(time series analysis)等，但是還沒有一種“標(biāo)準(zhǔn)”的統(tǒng)計方法。