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質(zhì)粒載體pBR322

 binhuren 2011-12-07


質(zhì)粒載體pBR322　　質(zhì)粒載體pBR322是研究得最多，使用最早且應(yīng)用最廣泛的大腸桿菌質(zhì)粒載體之一。符號(hào)質(zhì)粒載體pBR322中的“p代表質(zhì)粒；“BR”代表兩位兩位研究者Bolivar和Rogigerus姓氏的字首，“322”是實(shí)驗(yàn)編號(hào)。
　　pBR322是一個(gè)人工構(gòu)建的重要質(zhì)粒，有萬能質(zhì)粒之稱。它是由pSF2124、pMB8及pSC101三個(gè)親本質(zhì)粒經(jīng)復(fù)雜的重組過程構(gòu)建而成的。
　　質(zhì)粒載體pBR322的大小為4361bp，相對(duì)分子質(zhì)量較小的是它第一個(gè)優(yōu)點(diǎn)。優(yōu)點(diǎn)之二是它帶有一個(gè)復(fù)制起始位點(diǎn)，保證了該質(zhì)粒只在大腸桿菌的細(xì)胞中行使復(fù)制的功能。具有兩種抗生素抗性基因——氨芐青霉素抗性基因和四環(huán)素抗性基因，可供轉(zhuǎn)化子的選擇標(biāo)記是它的第三個(gè)優(yōu)點(diǎn)。
　　質(zhì)粒載體pBR322的第四個(gè)優(yōu)點(diǎn)是具有較高的拷貝數(shù)，經(jīng)過氯霉素?cái)U(kuò)增以后，每個(gè)細(xì)胞中可累積1000-3000份拷貝，該特性為重組體DNA的制備提供了極大的方便。
　　同時(shí)，由于其為人工構(gòu)建質(zhì)粒，雖然帶有抗藥性基因，但已不能在自然界的宿主細(xì)胞間轉(zhuǎn)移，同時(shí)應(yīng)用安全菌株，亦不會(huì)引起抗生素抗性基因傳播。


pBR322質(zhì)粒載體的結(jié)構(gòu)

pBR322質(zhì)粒載體的基因組圖譜如下：
pBR322質(zhì)粒DNA分子的長(zhǎng)度為4363bp，此載體中有兩個(gè)標(biāo)記基因，一個(gè)是氨芐青霉素抗性基因（Apr），另一個(gè)是四環(huán)素抗性基因（Tetr）?，F(xiàn)在已知pBR322DNA分子共有24種核酸內(nèi)切限制酶的單一識(shí)別位點(diǎn)。其中7種限制酶（從12：00位置按順時(shí)針方向）即EcoRV、NheI、BamHI、SphI、SalI、XmaIII和NruI的識(shí)別位點(diǎn)位于四環(huán)素抗性基因內(nèi)部，另
外有2 種限制酶即ClaI和HindIII的識(shí)別位點(diǎn)是存在于這個(gè)基因的啟動(dòng)區(qū)內(nèi)，在這9個(gè)限制位點(diǎn)上插入外源DNA都會(huì)導(dǎo)致tetr的失活。3種限制酶即ScaI、PvuI和PstI的識(shí)別位點(diǎn)位于氨芐青霉素抗性基因內(nèi)，在這些位點(diǎn)插入外源DNA則會(huì)導(dǎo)致ampr基因的失活。由pBR322質(zhì)粒載體的結(jié)構(gòu)可知其具有如下優(yōu)點(diǎn)：（1）具有較小的分子量。經(jīng)驗(yàn)表明，為了避免在DNA的純化過程中發(fā)生鏈的斷裂，克隆載體的分子大小最好不要超過10Kb。pBR322質(zhì)粒這種小分子量的特點(diǎn)，不僅易于自身DNA的純化，而且可容納較大的外源DNA片段；（2）具有兩種抗菌素抗性基因可供作轉(zhuǎn)化子的選擇記號(hào)，能指示載體或重組DNA分子是否進(jìn)入宿主細(xì)胞以及外源DNA分子是否插入載體分子形成了重組子。標(biāo)記基因往往可以賦予宿主細(xì)胞一種新的表型，這種轉(zhuǎn)化細(xì)胞可明顯地區(qū)別于非轉(zhuǎn)化細(xì)胞。當(dāng)我們把一個(gè)DNA片段插入到某一個(gè)標(biāo)記基因內(nèi)時(shí)，該基因就失去了相應(yīng)的功能。當(dāng)把這種重組DNA分子轉(zhuǎn)到宿主細(xì)胞后，該基因原來賦予的表型也就消失了。要是仍保留了原來表型的轉(zhuǎn)化細(xì)胞，細(xì)胞內(nèi)含有的DNA分子一定不是重組子。很顯然，既要指示外源DNA是否進(jìn)入了宿主細(xì)胞，又要指示載體DNA分子中是否插入了外源DNA片段，那么這種載體必須至少具有兩個(gè)標(biāo)記基因。另外，pBR322質(zhì)粒載體還具較高的拷貝數(shù)，而且經(jīng)過氯霉素?cái)U(kuò)增之后，每個(gè)細(xì)胞中可積累1000~3000個(gè)拷貝，這就為重組體DNA的制備提供了極大的方便。

pBR322質(zhì)粒載體的構(gòu)建
pBR322質(zhì)粒載體的構(gòu)建過程可簡(jiǎn)單地概括如下：
1、由于pBR322質(zhì)粒的親本之一是pMB1質(zhì)粒，故首先以pMB1為基礎(chǔ)，引入Rldrd19質(zhì)粒的Tn3易位子，得到13.3kb的pMB3質(zhì)粒；
2、pMB3的分子量顯然使得它不適合作為載體，所以要通過在EcoRI活性條件下的消化讓它大部分的無用片段失去，留下來的小片段的DNA的黏性末端連接起來后就形成了pMB8質(zhì)粒（2.6kb）；
3、此時(shí)，另外一種pSC101質(zhì)粒在EcoRI活性條件下消化產(chǎn)生了含有tetr抗性的DNA片斷，這個(gè)片斷和pMB8整合在一起就形成了pMB9質(zhì)粒（5.3kb）。此時(shí)pMB9為ampstetr表型；
4、pMB9已經(jīng)初步具備載體的功能，為了讓它更加完善，我們要讓它具備amprtetr性能，即在pMB9上引入pSF2124的Tn3易位子，但Tn3可以來也可以走，為了留住它，我們切去了Tn3中表達(dá)轉(zhuǎn)位酶的基因，形成了pBR313質(zhì)粒。
此后我們兵分兩路：一路把pBR313的PstI位點(diǎn)除去，使之成為ampstetr表型的pBR318質(zhì)粒；
5、；另一路把pBR313的EcoRII的位點(diǎn)切除，使之成為amprtets表形的pBR320質(zhì)粒。
由此我們的到了兩種功能互補(bǔ)的質(zhì)粒，這樣我們只要將他們雜交就可以得到一種接近全能的載體質(zhì)粒了，這就是pBR322 。
pBR322的應(yīng)用
了解了pBR322的結(jié)構(gòu)和它的構(gòu)建過程之后，我們來看pBR322在基因工程中的應(yīng)用。
pBR322質(zhì)粒作為一種常用的基因克隆載體，在實(shí)際應(yīng)用中有著非常重要的地位，其中一個(gè)突出的例子就是應(yīng)用pBR322 作為克隆載體對(duì)水稻的葉綠體光誘導(dǎo)基因psbA 進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析。
將水稻葉綠體的DNA，用EcoRI核酸限制性內(nèi)切酶消化之后，放入含有溴化乙錠的低熔點(diǎn)（LMP）的1%瓊脂糖凝膠中作電泳分離。從LMP中分離出分子大小為1.8～2.5kb之間的DNA片段，再與同樣經(jīng)過了EcoRI核酸限制性內(nèi)切酶切割并用堿性磷酸酶作了脫磷酸處理的pBR322質(zhì)粒連接。然后，將混合物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌5346菌株，培養(yǎng)在氨芐青霉素選擇平板上，形成Ampr轉(zhuǎn)化子菌落群體。這樣就構(gòu)成了由EcoRI核酸限制性內(nèi)切酶切割的水稻葉綠體DNA基因組庫。用Ampr轉(zhuǎn)化子菌落與32P放射性標(biāo)記的玉米psbA DNA 探針作菌落雜交，可以分離出其中的陽性克隆體。從這些陽性克隆體中分離出來的重組體質(zhì)粒DNA，經(jīng)過進(jìn)一步的分析，就能測(cè)出水稻葉綠體基因psbA的序列。
利用pBR322作為載體重組人體的抑生長(zhǎng)激素也是一個(gè)經(jīng)常提到的應(yīng)用例子。其過程和水稻葉綠體基因重組大同小異，只是除了在質(zhì)粒載體上插入抑生長(zhǎng)激素基因外，還將含有l(wèi)ac操縱子起始部分的片段（包括啟動(dòng)子、操縱區(qū)、核糖體結(jié)合位點(diǎn)和β－半乳糖苷酶的主要部分）插在抑生長(zhǎng)激素基因的旁邊。由于有了lac操縱子的控制，重組基因產(chǎn)生的蛋白質(zhì)的調(diào)節(jié)就變得比較容易了。

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