一、Real-time qPCR發(fā)展史

Real-time qPCR就是在PCR擴(kuò)增過程中，通過熒光信號(hào)，對(duì)PCR進(jìn)程進(jìn)行實(shí)時(shí)檢測。由于在PCR擴(kuò)增的指數(shù)時(shí)期，模板的Ct 值和該模板的起始拷貝數(shù)存在線性關(guān)系，所以成為定量的依據(jù)。由于常規(guī)的PCR的缺點(diǎn)，real-time qPCR由于其操作簡便，靈敏度高，重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)發(fā)展非常迅速?，F(xiàn)在已經(jīng)涉及到生命科學(xué)研究的各個(gè)領(lǐng)域，比如基因的差異表達(dá)分析，SNP檢測，等位基因的檢測，藥物開發(fā)，臨床診斷，轉(zhuǎn)基因研究等。

在Real-time qPCR技術(shù)的發(fā)展過程中，定量PCR儀的發(fā)展起了至關(guān)重要的作用。1995年，美國PE公司（已經(jīng)并入Invitrogen公司）成功研制了Taqman技術(shù)，1996年推出了首臺(tái)熒光定量PCR檢測系統(tǒng)，通過檢測每個(gè)循環(huán)的熒光強(qiáng)度，通過Ct值進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。從而熒光定量PCR獲得廣泛應(yīng)用?，F(xiàn)在的定量PCR儀有ABI7000、7300、7500，7700、7900HT、StepOnePlusTM、StepOneTM、PRISM@StepOneTM系列；BIO-RAD的CFX96、iCycler iQ5@、MyiQ@、MJ Research Chromo4TM Opticon 系列；Stratagene MxTM系列；Roche LightCycler@系列；Eppendorf Masercycler@；Corbett Rotor-GeneTM；Cepheid SmartCycler@和BIOER的LineGene系列。

隨國內(nèi)生命科學(xué)的快速發(fā)展，科研水平不斷提高，發(fā)高水平文章已不再是新鮮事。與其同時(shí)，國內(nèi)公司經(jīng)過長期不懈的努力，也有自主研發(fā)的real-time PCR儀器生產(chǎn)比如西安天隆科技公司的TL系列儀器。

二、Real-time qPCR概述

1. Real-time qPCR原理

實(shí)時(shí)PCR就是在PCR擴(kuò)增過程中，通過熒光信號(hào)，對(duì)PCR進(jìn)程進(jìn)行實(shí)時(shí)檢測。一般來講，定量PCR儀包括：實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀主要由樣品載臺(tái)、基因擴(kuò)增熱循環(huán)組件、微量熒光檢測光學(xué)系統(tǒng)、微電路控制系統(tǒng)、計(jì)算機(jī)及應(yīng)用軟件組成。其中基因擴(kuò)增熱循環(huán)組件工作原理與傳統(tǒng)基因擴(kuò)增儀大致相同，不同廠家不同型號(hào)的產(chǎn)品分別采用空氣加熱、壓縮機(jī)制冷、半導(dǎo)體加熱制冷等工作方式。獨(dú)特是這個(gè)微量熒光檢測系統(tǒng)。有由熒光激發(fā)光學(xué)部件、微量熒光檢測部件、光路、控制系統(tǒng)組成。

常用的熒光激發(fā)方式有兩種：鹵鎢燈和LED；熒光檢測元件常用兩種方式：光電倍增管和冷光CCD攝像機(jī)，光單色元件有濾光片和光柵。在實(shí)時(shí)PCR擴(kuò)增過程中，熒光信號(hào)被收集，轉(zhuǎn)化為成為擴(kuò)增和熔解曲線。具體數(shù)據(jù)就是基線，熒光閾值和Ct值。

2. Real-time qPCR的數(shù)學(xué)原理

首先來看一個(gè)real-time qPCR中的重要參數(shù)Ct值（Ct value），閾值（threshold），和基線（baseline）。一般來講，第3-15個(gè)循環(huán)的熒光值就是基線，是由于測量的偶然誤差引起的。閾值一般是基線的標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍。在實(shí)際操作中也可以手動(dòng)調(diào)節(jié)，位于指數(shù)期就可以。Ct值就是熒光值達(dá)到閾值時(shí)候的PCR循環(huán)次數(shù)。所以是一個(gè)沒有單位的參數(shù)。

那么為什么說Ct值跟初始模板的量成反比呢？我們來看PCR的擴(kuò)增方程：

從線性方程上看，斜率（slope）為-1/lg(1+E)，所以E=10-1/slope-1。如果從標(biāo)準(zhǔn)曲線上得到斜率（-3.3），就可以算出擴(kuò)增效率（0.99）。一般來講PCR擴(kuò)增效率在90%-110%都是可以用于數(shù)據(jù)分析的。效率低于100%，是由于PCR反應(yīng)中存在抑制因素；而高于100%可能一些污染、非特異性擴(kuò)增或者是引物二聚體造成。

3. Real-time qPCR的種類

根據(jù)real-time qPCR的化學(xué)發(fā)光原理可以分為2大類：一類為探針類，包括TaqMan@探針和分子信標(biāo)，利用與靶序列特異雜交的探針來指示擴(kuò)增產(chǎn)物的增加；一類為非探針類，其中包括如SYBR@Green I或者特殊設(shè)計(jì)的引物(如LUX@Primers) 通過熒光染料來指示產(chǎn)物的增加。

3.1 Taqman@探針法

Taqman@探針是最早用于定量的方法。就在PCR擴(kuò)增時(shí)加入一對(duì)引物的同時(shí)加入一個(gè)特異性的熒光探針，該探針為一寡核苷酸：5’端標(biāo)記一個(gè)報(bào)告熒光基團(tuán)，3’端標(biāo)記一個(gè)淬滅熒光基團(tuán)。探針完整時(shí)，報(bào)告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號(hào)被淬滅基團(tuán)吸收，也就是FRET反應(yīng)；PCR擴(kuò)增時(shí)，Taq酶的5'-3'外切酶活性將探針酶切降解，使報(bào)告熒光基團(tuán)和淬滅熒光基團(tuán)分離，從而熒光監(jiān)測系統(tǒng)可接收到熒光信號(hào)，即每擴(kuò)增一條DNA鏈，就有一個(gè)熒光分子形成，實(shí)現(xiàn)了熒光信號(hào)的累積與PCR產(chǎn)物形成完全同步。而新型TaqMan-MGB探針使該技術(shù)既可進(jìn)行基因定量分析，又可分析基因突變（SNP），有望成為基因診斷和個(gè)體化用藥分析的首選技術(shù)平臺(tái)。

3.2 分子信標(biāo)法

分子信標(biāo)：一種在靶DNA不存在時(shí)形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)的雙標(biāo)記寡核苷酸探針。在此發(fā)夾結(jié)構(gòu)中，位于分子一端的熒光基團(tuán)與分子另一端的淬滅基團(tuán)緊緊靠近。分子信標(biāo)的莖環(huán)結(jié)構(gòu)中，環(huán)一般為15-30個(gè)核苷酸長，并與目標(biāo)序列互補(bǔ)；莖一般5-7個(gè)核苷酸長，并相互配對(duì)形成莖的結(jié)構(gòu)。熒光基團(tuán)連接在莖臂的一端，而淬滅劑則連接于另一端。分子信標(biāo)必須非常仔細(xì)的設(shè)計(jì)，以致于在復(fù)性溫度下，模板不存在時(shí)形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)，模板存在時(shí)則與模板配對(duì)。與模板配對(duì)后，分子信標(biāo)的構(gòu)象改變使得熒光基團(tuán)與淬滅劑分開。當(dāng)熒光基團(tuán)被激發(fā)時(shí)，它發(fā)出自身波長的光子。

3.3 SYBR@Green 法

SYBR@Green I是一種結(jié)合于小溝中的雙鏈DNA結(jié)合染料，與雙鏈DNA結(jié)合后，其熒光大大增強(qiáng)。這一性質(zhì)使其用于擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測非常理想。SYBR@Green I 的最大吸收波長約為497nm，發(fā)射波長最大約為520nm。在PCR反應(yīng)體系中，加入過量SYBR@Green 熒光染料，SYBR@Green 熒光染料特異性地?fù)饺隓NA雙鏈后，發(fā)射熒光信號(hào)，而不摻入鏈中的SYBR@Green 染料分子不會(huì)發(fā)射任何熒光信號(hào)，從而保證熒光信號(hào)的增加與PCR產(chǎn)物的增加完全同步。

3.4 LUX@Primers法

LUX@ (light upon extention) 引物是利用熒光標(biāo)記的引物實(shí)現(xiàn)定量的一項(xiàng)新技術(shù)。目標(biāo)特異的引物對(duì)中的一個(gè)引物3’端用熒光報(bào)告基團(tuán)標(biāo)記。在沒有單鏈模板的情況下，該引物自身配對(duì)，形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，使熒光淬滅。在有目標(biāo)片斷的時(shí)候，引物與模板配對(duì)，發(fā)夾結(jié)構(gòu)打開，產(chǎn)生特異的熒光信號(hào)。

4. Real-time qPCR和常規(guī)PCR的區(qū)別

實(shí)時(shí)檢測（在對(duì)數(shù)擴(kuò)增時(shí)期）而不是終點(diǎn)檢測

敏感性高

需要樣品少

特異性高

精確定量

三、Real-time qPCR實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)其實(shí)比實(shí)驗(yàn)本身更重要！好的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)可以事半功倍，節(jié)省時(shí)間！尤其做生物實(shí)驗(yàn)，一定要查詢盡可能完全的相關(guān)資料，整理好思路，設(shè)計(jì)好實(shí)驗(yàn)路線。當(dāng)然實(shí)驗(yàn)過程中出現(xiàn)各種各樣的變化，但有足夠多的背景知識(shí)，就可以分析原因，才有可能創(chuàng)新。對(duì)于一個(gè)real-time qPCR而言，首先就是實(shí)驗(yàn)材料的處理和準(zhǔn)備；然后引物設(shè)計(jì)，這步至關(guān)重要，好的引物是實(shí)驗(yàn)本身成功的50%；進(jìn)行實(shí)驗(yàn)和數(shù)據(jù)分析（這一部分單獨(dú)說明）。

1. 實(shí)驗(yàn)材料的處理和準(zhǔn)備

以最基本的基因表達(dá)差異分析為例。實(shí)驗(yàn)材料分為對(duì)照組（CON）和處理組（TRT）。組內(nèi)要有生物重復(fù)，可以數(shù)據(jù)分析此處理是否有統(tǒng)計(jì)意義。在材料收集過程中，盡量避免RNA的降解（尤其對(duì)于絕對(duì)定量的樣品）。

一般傳統(tǒng)的收集材料的方法是樣品采集立刻液氮速凍，然后迅速轉(zhuǎn)移到超低溫冰箱保存，但這種方法攜帶不方便，由于對(duì)于異地取材?，F(xiàn)在新技術(shù)的發(fā)展，也有一些非液氮類的樣品儲(chǔ)存液 ，比如***的RNAfixer 。

2. 引物設(shè)計(jì)

一般real-time PCR引物的設(shè)計(jì)遵循下面一些原則：

擴(kuò)增產(chǎn)物長度在80-150bp。

引物應(yīng)用核酸系列保守區(qū)內(nèi)設(shè)計(jì)并具有特異性。

產(chǎn)物不能形成二級(jí)結(jié)構(gòu)。

產(chǎn)物長度一般在15-30堿基之間。

G+C含量在40%-60%之間。

堿基要隨機(jī)分布。

引物自身不能有連續(xù)4個(gè)堿基的互補(bǔ)。

引物之間不能有連續(xù)4個(gè)堿基的互補(bǔ)。

引物5’端可以修飾。

引物3’端不可修飾。

引物3’端要避開密碼子的第3位。

Taqman@探針的設(shè)計(jì)稍有不同，一般有公司設(shè)計(jì)合成。遵循下面以下原則：

盡量靠在上游引物；

長度30-45bp，Tm比引物高至少5℃；

5’端不要是G，G會(huì)有淬滅作用，影響定量

四、Real-time qPCR操作過程

1. RNA提取和反轉(zhuǎn)錄

在抽提RNA過程中任一環(huán)節(jié)的不正確操作都可能導(dǎo)致RNA酶的污染。由于RNA酶的活性很難完全抑制，預(yù)防其污染是十分必要的。在實(shí)際的操作中應(yīng)遵循下面一些原則：

1. 全程佩戴一次性手套。皮膚經(jīng)常帶有細(xì)菌和霉菌，可能污染RNA的抽提并成為RNA酶的來源。培養(yǎng)良好的微生物實(shí)驗(yàn)操作習(xí)慣預(yù)防微生物污染。

2. 使用滅菌的，一次性的塑料器皿和自動(dòng)吸管抽提RNA，避免使用公共儀器所導(dǎo)致的RNA酶交叉污染。例如，使用RNA探針的實(shí)驗(yàn)室可能用RNA酶A或T1來降低濾紙上的背景，因而某些非一次性的物品（如自動(dòng)吸管）可能富含RNA酶。

3. 在提取裂解液中，RNA是隔離在RNA酶污染之外的。而對(duì)樣品的后續(xù)操作會(huì)要求用無RNA酶的非一次性的玻璃器皿或塑料器皿。玻璃器皿可以在150°C的烘箱中烘烤4小時(shí)。塑料器皿可以在0.5M NaOH中浸泡10分鐘，用水徹底漂洗干凈后高壓滅菌備用。

當(dāng)然，這些也不是絕對(duì)的要求。如果是操作熟練。完全可以用初次開封的離心管和槍頭，新過濾的超純水，進(jìn)行RNA的提取。

2.Mix配制

一般來講，進(jìn)行real-time qPCR MasterMix都是2×的濃縮液，只需要加入模板和引物就可以。由于real-time qPCR靈敏度高，所以每個(gè)樣品至少要做3個(gè)平行孔，以防在后面的數(shù)據(jù)分析中，由于Ct相差較多或者SD太大，無法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。通常來講，反應(yīng)體系的引物終濃度為100-400mM；模板如果是總RNA一般是10ng-500，如果cDNA，通常情況下是1ul或者1ul的10倍稀釋液，要根據(jù)目的基因的表達(dá)豐度進(jìn)行調(diào)整。當(dāng)然這些都是經(jīng)驗(yàn)值，在操作過程中，還需要根據(jù)所用MasterMix，模板和引物的不同進(jìn)行優(yōu)化，達(dá)到一個(gè)最佳反應(yīng)體系。在反應(yīng)體系配置過程中，有下面幾點(diǎn)需要注意：

1. MasterMix不要反復(fù)凍融，如果經(jīng)常使用，最好溶解后放在4度。

2. 更多的配制Mix進(jìn)行，減少加樣誤差。最好能在冰上操作。

3. 每管或每孔都要換新槍頭！不要連續(xù)用同一個(gè)槍頭加樣！

4. 所有成分加完后，離心去除氣泡。

5. 每個(gè)樣品至少3個(gè)平行孔。

參比或者校正染料（reference dye，passive dye）常用的是ROXTM（現(xiàn)在已經(jīng)是ABI的注冊(cè)商標(biāo)了?。┗蛘咂渌玖?，只要不影響檢測PCR產(chǎn)物的熒光值就可以。參比染料的作用是標(biāo)準(zhǔn)化熒光定量反應(yīng)中的非PCR震蕩，校正加樣誤差或者是孔與孔之間的誤差，提供一個(gè)穩(wěn)定的基線。現(xiàn)在很多公司已經(jīng)把ROXTM配制在MasterMix或者Premixture里。如果反應(yīng)曲線良好或已經(jīng)優(yōu)化好反應(yīng)體系，也可以不加ROXTM染料校正。

通常來講，real-time qPCR的反應(yīng)程序不需要像常規(guī)的PCR那樣，要變性、退火、延伸3步。由于其產(chǎn)物長度在80-150bp 之間，所以只需要變性和退火就可以了。SYBR@Green等染料法，最好在PCR擴(kuò)增程序結(jié)束后，加一個(gè)溶解程序，來形成溶解曲線，判斷PCR產(chǎn)物的特異性擴(kuò)增。而溶解程序，儀器都有默認(rèn)設(shè)置，或稍有不同，但都是一個(gè)在產(chǎn)物進(jìn)行溶解時(shí)候，進(jìn)行熒光信號(hào)的收集。

3. 儀器設(shè)置

所有儀器的操作都基本一致。設(shè)置的時(shí)候包括反應(yīng)板設(shè)置（plate setup）和程序設(shè)置（program setup）。我們以 ABI StepOne為例，詳細(xì)看一下反應(yīng)設(shè)置：

A. 首先是實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪x擇：定量還是其他。我們命名為“BioTeke”，進(jìn)行“定量”實(shí)驗(yàn)。

B. 實(shí)驗(yàn)方法的選擇：我們選用的比較Ct的SYBR Green方法， Fast程序，以cDNA為模板進(jìn)行。

C. 目的基因的設(shè)置：有幾個(gè)目的基因和目的基因的名稱。

D. 樣品的設(shè)置：包括哪個(gè)是實(shí)驗(yàn)組，哪個(gè)是對(duì)照組。以及負(fù)對(duì)照的設(shè)置和生物重復(fù)的設(shè)置。

E. 對(duì)照組和內(nèi)參基因的設(shè)置：這個(gè)是為后面的定量做準(zhǔn)備

F. 反應(yīng)程序的設(shè)置：PCR反應(yīng)程序的設(shè)置要根據(jù)不同公司的MasterMix。比如BioTeke的95℃ 2分鐘就可以激活DNA聚合酶（ABI的需要10 分鐘）。循環(huán)反應(yīng)是95℃15秒，60℃15秒的40個(gè)循環(huán)。溶解曲線程序采用儀器默認(rèn)設(shè)置就可以。或者是儀器說明書上建議的程序。

G. 反應(yīng)體系的設(shè)置：

A-G這五個(gè)步驟簡單設(shè)置好，可以保存，修改反應(yīng)程序或者立刻進(jìn)行反應(yīng)。

需要注意一點(diǎn)ABI儀器需要加ROX參比染料，默認(rèn)的是ROX。有些公司是把ROX或者其他染料配制在MasteMix里面；也有的是單獨(dú)分開。要根據(jù)不同公司的MasterMix進(jìn)行這一個(gè)步驟的選擇。BioTeke的MasterMix里沒有參比染料，所以選擇“none”。

設(shè)置好之后，就可以把配置好的PCR管放進(jìn)儀器，點(diǎn)擊RUN！

五、Real-time qPCR數(shù)據(jù)分析

1. Real-time qPCR常見參數(shù)

基線（baseline）

通常是3-15個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)

同一次反應(yīng)中針對(duì)不同的基因需單獨(dú)設(shè)置基線

閾值（threshold）

自動(dòng)設(shè)置是3-15個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)的標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍

手動(dòng)設(shè)置：置于指數(shù)擴(kuò)增期，剛好可以清楚地看到熒光信號(hào)明顯增強(qiáng)。

同一次反應(yīng)中針對(duì)不同的基因可單獨(dú)設(shè)置閾值，但對(duì)于同一個(gè)基因擴(kuò)增一定要用同一個(gè)閾值。

Ct值:與起始濃度的對(duì)數(shù)成線性關(guān)系。

分析定量時(shí)候一般取Ct:15-35。太大或者太小都會(huì)導(dǎo)致定量的不準(zhǔn)確。

Rn（Normalized reporter）是熒光報(bào)告基團(tuán)的熒光發(fā)射強(qiáng)度與參比染料的熒光發(fā)射強(qiáng)度的比值。

△Rn：△Rn是Rn扣除基線后得到的標(biāo)準(zhǔn)化結(jié)果（△Rn=Rn-基線）。

2.影響Ct值的關(guān)鍵因素

模板濃度

模板濃度是決定Ct的最主要因素?？刂圃谝粋€(gè)合適范圍內(nèi)，使Ct在15-35之間。

反應(yīng)液成分的影響

任何分子的熒光發(fā)射都受環(huán)境因素影響----比如溶液的pH值和鹽濃度。

PCR反應(yīng)的效率

PCR反應(yīng)的效率也會(huì)影響Ct值。在PCR擴(kuò)增效率低的條件下進(jìn)行連續(xù)梯度稀釋擴(kuò)增，與PCR擴(kuò)增效率高的條件下相比，可能會(huì)所產(chǎn)生斜率不同的標(biāo)準(zhǔn)曲線。PCR效率取決于實(shí)驗(yàn)、反應(yīng)混合液性能和樣品質(zhì)量。一般說來，反應(yīng)效率在90-110%之間都是可以接受的。

3. 如何評(píng)估實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)的效果

PCR擴(kuò)增效率：

為了正確地評(píng)估PCR擴(kuò)增效率，至少需要做3次平行重復(fù)，至少做5個(gè)數(shù)量級(jí)倍數(shù)(5logs)連續(xù)梯度稀釋模板濃度。

R2值：

另一個(gè)評(píng)估PCR效率的關(guān)鍵參數(shù)是相關(guān)系數(shù)R2，它是說明兩個(gè)數(shù)值之間相關(guān)程度的統(tǒng)計(jì)學(xué)術(shù)語。如果R2等于1，那么你可以用Y值（Ct）來準(zhǔn)確預(yù)測X值（量）。如果R2等于0，你就不能通過Y值來預(yù)測X值。R2值大于0.99 時(shí)，兩個(gè)數(shù)值之間相關(guān)的可信度很好。

精確度:

標(biāo)準(zhǔn)偏差（standard deviation，偏差的平方根）是最常用的精確度計(jì)量方法。如果許多數(shù)據(jù)點(diǎn)都靠近平均值，那么標(biāo)準(zhǔn)偏差就??；如果許多數(shù)據(jù)點(diǎn)都遠(yuǎn)離平均值，則標(biāo)準(zhǔn)偏差就大。實(shí)際上，足夠多重復(fù)次數(shù)產(chǎn)生的數(shù)據(jù)組會(huì)形成大致的正態(tài)分布。這經(jīng)?？赏ㄟ^經(jīng)典的中心極限理論來證明，獨(dú)立同分布隨機(jī)變量在無限多時(shí)趨向于正態(tài)分布。如果PCR反應(yīng)效率是 100%，那么2倍稀釋點(diǎn)之間的平均Ct間隔應(yīng)該恰為1個(gè)Ct值。要以99.7%的幾率分辨2倍稀釋濃度，標(biāo)準(zhǔn)偏差就必須小于等于0.167。標(biāo)準(zhǔn)偏差越大，分辨2倍稀釋的能力就越低。為了能夠在95%以上的情況下分辨出2倍稀釋，標(biāo)準(zhǔn)偏差必須小于等于 0.250。

靈敏度：

無論CT絕對(duì)值是多少，任何能夠有效擴(kuò)增和檢測起始模板拷貝數(shù)為1的系統(tǒng)都達(dá)到了靈敏度的極限。PCR效率是決定反應(yīng)靈敏度的關(guān)鍵因素。在檢測極低拷貝數(shù)時(shí)的另一個(gè)重要的考慮因素是，低拷貝時(shí)的模板數(shù)量不能按普通情況來預(yù)期。相反，它會(huì)遵循泊松分布，即進(jìn)行大量的平行重復(fù)，平均應(yīng)該含有一個(gè)拷貝的起始模板，實(shí)際上約37%不含有拷貝，僅有約37%含有1個(gè)拷貝，約18%實(shí)際上含有兩個(gè)拷貝。因此，為了更可靠地檢測低拷貝，必須做大量的平行重復(fù)實(shí)驗(yàn)來提供統(tǒng)計(jì)顯著性，并克服泊松分布的限制。 評(píng)價(jià)熒光PCR結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)

因素 建議 指標(biāo)

效率 5個(gè)數(shù)量級(jí)梯度稀釋 Slope～-3.3 R2>0.99

精密度 至少3個(gè)重復(fù) 標(biāo)準(zhǔn)差<0.25（0.5或者1個(gè)Ct之內(nèi)）

靈敏度 增加低濃度樣本的重復(fù)數(shù) 統(tǒng)計(jì)分析

除了這些因素，還必須評(píng)估和驗(yàn)證合適的實(shí)驗(yàn)對(duì)照（如無模板對(duì)照，無 反轉(zhuǎn)錄酶對(duì)照等）以及模板質(zhì)量。

3. Real-time qPCR定量方法

可以分絕對(duì)定量和相對(duì)定量。絕對(duì)定量是用一系列已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)品制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，在相同的條件下目的基因測得的熒光信號(hào)量同標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行比較，從而得到目的基因的量。該標(biāo)準(zhǔn)品可以是純化的質(zhì)粒DNA，體外轉(zhuǎn)錄的RNA，或者是體外合成的ssDNA。相對(duì)定量可以分比較Ct法和其他一些相對(duì)方法。比較Ct指的是通過與內(nèi)參基因Ct值之間的相差來計(jì)算基因表達(dá)差異,也稱之是2-△△Ct。

3.1 絕對(duì)定量

3.2 2-△△Ct定量

3.3 其他定量方法

Marisa L. Wong and Juan F. Medrano: BioTechniques July 2005

六、Real-Time qPCR常見問題分析

1.無Ct值出現(xiàn)

檢測熒光信號(hào)的步驟有誤: 一般SG法采用72℃延伸時(shí)采集，Taqman法則一般在退火結(jié)束時(shí)或延伸結(jié)束采集信號(hào)。

引物或探針降解: 可通過PAGE電泳檢測其完整性。

模板量不足: 對(duì)未知濃度的樣品應(yīng)從系列稀釋樣本的最高濃度做起。

模板降解: 避免樣品制備中雜質(zhì)的引入及反復(fù)凍融的情況。

2. Ct值出現(xiàn)過晚（Ct>38）

擴(kuò)增效率低: 反應(yīng)條件不夠優(yōu)化。設(shè)計(jì)更好的引物或探針；改用三步法進(jìn)行反應(yīng)；適當(dāng)降低退火溫度；增加鎂離子濃度等。

PCR各種反應(yīng)成分的降解或加樣量的不足。

PCR產(chǎn)物太長: 一般采用80-150bp的產(chǎn)物長度。

3. 標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系不佳

加樣存在誤差: 使得標(biāo)準(zhǔn)品不呈梯度。

標(biāo)準(zhǔn)品出現(xiàn)降解: 應(yīng)避免標(biāo)準(zhǔn)品反復(fù)凍融，或重新制備并稀釋標(biāo)準(zhǔn)品。

引物或探針不佳: 重新設(shè)計(jì)更好的引物和探針。

模板中存在抑制物，或模板濃度過高

4. 負(fù)對(duì)照有信號(hào)

引物設(shè)計(jì)不夠優(yōu)化：應(yīng)避免引物二聚體和發(fā)夾結(jié)構(gòu)的出現(xiàn)。

引物濃度不佳：適當(dāng)降低引物的濃度，并注意上下游引物的濃度配比。

鎂離子濃度過高：適當(dāng)降低鎂離子濃度，或選擇更合適的mix試劑盒。

模板有基因組的污染：RNA提取過程中避免基因組DNA的引入，或通過引物設(shè)計(jì)避免非特異擴(kuò)增。

5. 溶解曲線不止一個(gè)主峰

引物設(shè)計(jì)不夠優(yōu)化：應(yīng)避免引物二聚體和發(fā)夾結(jié)構(gòu)的出現(xiàn)。

引物濃度不佳：適當(dāng)降低引物的濃度，并注意上下游引物的濃度配比。

鎂離子濃度過高：適當(dāng)降低鎂離子濃度，或選擇更合適的 mix 試劑盒。

模板有基因組的污染：RNA提取過程中避免基因組DNA的引入，或通過引物設(shè)計(jì)避免非特異擴(kuò)增。

6. 擴(kuò)增效率低

反應(yīng)試劑中部分成分特別是熒光染料降解。

反應(yīng)條件不夠優(yōu)化：可適當(dāng)降低退火溫度或改為三步擴(kuò)增法。

反應(yīng)體系中有PCR反應(yīng)抑制物：一般是加入模板時(shí)所引入，應(yīng)先把模板適度稀釋，再加入反應(yīng)體系中，減少抑制物的影響。

7. 同一試劑在不同儀器上產(chǎn)生不同的曲線，如何判斷？

判斷標(biāo)準(zhǔn)：擴(kuò)增效率，靈敏度，特異性

如果擴(kuò)增效率在90%-110%，都是特異性擴(kuò)增，都可以把數(shù)據(jù)用于分析。

8. 擴(kuò)增曲線的異常？比如“S”型曲線？

參比染料設(shè)定不正確(MasterMix不加參比染料時(shí)，選NONE)

模板的濃度太高或者降

熒光染料的降解