熒光定量PCR檢測技術(shù)從誕生到現(xiàn)在已經(jīng)有 8 年了，但是其應(yīng)用在近四年才迅猛增長。在 Medline 數(shù)據(jù)庫中，用“ Taqman” 或 ”real time PCR” 作為關(guān)鍵詞檢索，在1996 年僅有 19 篇，在 1997 年僅有 28 篇，在 98 、 99 、2000 年分別達(dá)到了 52 、 157 、 409 篇， 2003 年已經(jīng)達(dá)到2984 篇，相信在不久的將來會有更多的文章發(fā)表。針對實時 PCR 這一熱點領(lǐng)域，我們對它進(jìn)行了深入細(xì)致的研究，并且及時地為廣大科研人員推出這項技術(shù)服務(wù)。

熒光定量PCR基本原理
Taqman 技術(shù)：該技術(shù)以美國 ABI 公司為代表。 PCR 擴(kuò)增時，在加入一對引物的同時加入一個特異性的熒光探針。該探針為一直線型的寡核苷酸，兩端分別標(biāo)記一個熒光報告基團(tuán)和一個熒光淬滅基團(tuán)，探針完整時，報告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號被淬滅基團(tuán)吸收， PCR 儀檢測不到熒光信號； PCR 擴(kuò)增時（在延伸階段）， Taq 酶的 5' － 3' 外切酶活性將探針酶切降解，使報告熒光基團(tuán)和淬滅熒光基團(tuán)分離，從而熒光監(jiān)測系統(tǒng)可接收到熒光信號，即每擴(kuò)增一條 DNA 鏈，就有一個熒光分子形成，實現(xiàn)了熒光信號的累積與 PCR 產(chǎn)物形成完全同步，這也是定量的基礎(chǔ)所在。

Beacon 技術(shù)：該技術(shù)以美國人 Tagyi 為代表。也是加入了熒光探針，但它是環(huán)狀的寡核苷酸探針，分別由莖部和環(huán)部組成， 兩端分別標(biāo)記 熒光報告基團(tuán)和熒光猝滅基團(tuán)，在無靶序列的情況下，探針始終是環(huán)狀，報告基團(tuán)的熒光被猝滅基團(tuán)猝滅，使熒光檢測儀檢測不到熒光信號；而在有靶序列時，即在 PCR 的退火階段探針與靶序列結(jié)合，使熒光報告基團(tuán)和猝滅基團(tuán)分開，這樣熒光儀可以檢測到熒光，熒光信號的強(qiáng)弱代表了靶序列的多少。

FRET 技術(shù)：該技術(shù)以 Roche( 羅氏公司 ) 為代表。它的基本原理是：兩條直線型寡核苷酸探針，其中一條的 3 ‘端標(biāo)記熒光激發(fā)基團(tuán)，另一條的 5 ' 端標(biāo)記熒光檢測基團(tuán)，在無靶序列的情況下，兩條探針分開，無法進(jìn)行能量的傳遞，這樣熒光儀不能檢測到熒光信號；而當(dāng)有靶序列時，即在 PCR 的退火階段兩條探針與靶序列結(jié)合，使得兩條探針上的熒光基團(tuán)可以進(jìn)行能量的傳遞，這樣熒光儀就可以檢測到熒光信號，熒光信號的強(qiáng)弱代表了靶序列的多少。

實時熒光定量PCR中的幾個俗語
·  Ct 值：是指每個反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號到達(dá)設(shè)定的域值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。
·  熒光域值（ threshold ）：是指 PCR 反應(yīng)的前 15 個循環(huán)的熒光信號，熒光域值的缺省設(shè)置是 3-15 個循環(huán)的熒光信號的標(biāo)準(zhǔn)偏差的 10 倍，即： threshold.
·  Ct 值與起始模板的關(guān)系：研究表明，每個模板的 Ct 值與該模板的起始拷貝數(shù)的對數(shù)存在線性關(guān)系〔 1 〕，起始拷貝數(shù)越多， Ct 值越小。利用已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品可作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，其中橫坐標(biāo)代表起始拷貝數(shù)的對數(shù)，縱坐標(biāo)代 Ct 值。因此，只要獲得未知樣品的 Ct 值，即可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上計算出該樣品的起始拷貝數(shù)。

熒光定量PCR應(yīng)用廣泛
·  可以對各種基因的表達(dá)進(jìn)行定量分析，如：同一基因在不同組織中的表達(dá)差異、同一基因在不同藥物處理后的表達(dá)差異、轉(zhuǎn)基因食品的檢測。過去最常用的高通量篩選基因表達(dá)差異的技術(shù)是 cDNA 芯片和差異顯示，但這兩種技術(shù)的缺點是只能定性而非完整意義上的定量分析。實時 PCR 技術(shù)和高通道實時 PCR 儀的出現(xiàn)，無疑為這種檢測提供了極大的方便。
·  可以進(jìn)行點突變分析和等位基因分析，用不同的熒光報告基團(tuán)標(biāo)記 Taqman 探針，然后分別與野生型和突變型雜交，如果一種熒光信號明顯強(qiáng)于另一種熒光信號，則表明它是純合子；如果兩種熒光信號都明顯增強(qiáng)，則表明它是雜合子。另外分子信標(biāo)（ Molecular Beacon ）就是專門為這種技術(shù)設(shè)計的探針。
·  可以進(jìn)行單核苷酸多態(tài)性的分析，檢測單核苷酸多態(tài)性對于研究個體對不同疾病的易感性或者個體對特定藥物的不同反應(yīng)有著重要的意義，因分子信標(biāo)結(jié)構(gòu)的巧妙性，一旦 SNP 的序列信息是已知的，采用這種技術(shù)進(jìn)行高通量的 SNP 檢測將會變得簡單而準(zhǔn)確。
·  可以進(jìn)行 DNA 甲基化檢測， DNA 甲基化同人類的許多疾病有關(guān)，特別是癌癥， Laird 報道了一種稱作 Methylight 的技術(shù)，在擴(kuò)增之前先處理 DNA ，使得未甲基化的胞嘧啶變成尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不受影響，用特異性的引物和 Taqman 探針來區(qū)分甲基化和非甲基化的 DNA ，這種方法不僅方便而且靈敏度更高。
·  對傳染性疾病進(jìn)行定量定性分析，這在我國應(yīng)用比較廣泛，大家比較熟悉。許多生產(chǎn)臨床 PCR 試劑的廠商已經(jīng)陸續(xù)推出了一系列的診斷試劑，如：肝炎系列、性病系列、腫瘤系列等等。

熒光定量PCR技術(shù)服務(wù)
熒光定量PCR用Taqman 方法對 DNA/RNA 進(jìn)行 real time PCR 的定量測定或型的鑒定。

熒光定量PCR服務(wù)要求
1. 請您提供新鮮的且盡量多的材料（各種材料的 RNA 提取量請參照“總 RNA 的提取”），或直接提供純化好的 總 RNA （大于 5 ug/ 樣品）；（ 各種材料的 DNA 提取量請參照“ DNA 的提取”），或直接提供純化好的 DNA （大于 5 ug/ 樣品 ) 。
2. 請通過 E-mail 提供已知的全長基因序列。
3. 請?zhí)峁┍M可能詳細(xì)的背景資料： DNA/ RNA 來源、豐度等

熒光定量PCR操作程序
1. 根據(jù)基因序列設(shè)計特異性的引物和熒光探針。
2. 提取 DNA/RNA 。
3. Real Time PCR(熒光定量PCR)，進(jìn)行實驗結(jié)果分析
4. 實驗完成后，提供完整的實驗報告（含軟件分析結(jié)果）及引物等實驗材料

熒光定量PCR收費標(biāo)準(zhǔn):
1、RNA提取：10－20個樣品的RNA提取是：150元/個；20－30個樣品的RNA提取是：120 元/個；30個以上樣品的RNA提取是：100元/個；每份材料最少應(yīng)提供：100mg/樣品
2、一個指標(biāo)每個樣品為150元；二個指標(biāo)每個樣品為240元；三指標(biāo)每個樣品為300元，三個指標(biāo)以上每個樣品為80元/反應(yīng)。
3、引物合成為每個堿基2.1元，探針標(biāo)記為1200元/條，如果是用sybr green I(染料)做，則免去探針的費用，染料贈送。
4、內(nèi)參的GAPDH引物探針免費，標(biāo)準(zhǔn)曲線免費贈送。
5、不再收取任何的基礎(chǔ)費或者開機(jī)費。

(如果樣本或者指標(biāo)數(shù)更多，再面議)

時間：接到樣品后1個月內(nèi)完成！
提供樣本：用干冰運輸，樣品重量在100mg左右；上海的用戶可以上門取標(biāo)本。
技術(shù)部免費設(shè)計引物探針，客戶只需提供標(biāo)本和genebank的ID號或者告訴我們指標(biāo)的名稱。

MicroRNA(miRNA)熒光定量PCR技術(shù)服務(wù)！

一、什么是miRNA?
MicroRNAs (miRNAs)是一種大小約21—23個堿基的單鏈小分子RNA，是由具有發(fā)夾結(jié)構(gòu)的約70-90個堿基大小的單鏈RNA前體經(jīng)過Dicer酶加工后生成，不同于siRNA（雙鏈）但是和siRNA密切相關(guān)。據(jù)推測，這些非編碼小分子RNA（miRNAs）參與調(diào)控基因表達(dá)，但其機(jī)制區(qū)別于siRNA介導(dǎo)的mRNA降解。第一個被確認(rèn)的miRNA是在線蟲中首次發(fā)現(xiàn)的lin-4 和let-7，隨后多個研究小組在包括人類、果蠅、植物等多種生物物種中鑒別出數(shù)百個miRN As 。

二、miRNA是如何產(chǎn)生的？

miRNAs 是轉(zhuǎn)錄后長片段的 RNA 分子（ pri-miRNA ）的一部分，首先在細(xì)胞核內(nèi)被雙鏈 RNA 特異的核酸酶Drosha 處理成為 70-100 個核苷酸組成的發(fā)夾結(jié)構(gòu) RNA （ pre-miRNA ）。這一發(fā)夾結(jié)構(gòu) RNA 運輸?shù)郊?xì)胞質(zhì)，被另一個雙鏈 RNA 特異的核酸酶 Dicer 剪切，得到 19-23 個 核苷酸組成的成熟的 miRNA ，結(jié)合在與 RNA 介導(dǎo)的沉默復(fù)合物（ RISC ）類似或者相同的復(fù)合物中，這個復(fù)合物參與了 RNA 干擾。由 miRNA 和靶基因 mRNA 的堿基配對引導(dǎo) RISC 降解目的片段或是阻礙其翻譯過程。 miRNA 和它的目的 mRNA 互補(bǔ)的堿基配對決定了這個過程的特異性。通過抑制翻譯還是降解發(fā)揮作用是由 miRNA 和它的目的 mRNA 之間的錯配程度決定的，匹配程度高的目的 mRNA 將被降解。由于 miRNAs 可以對不完全互補(bǔ)的 mRNA 配對來抑制蛋白質(zhì)的翻譯過程，因而每個 miRNA 可以有多個靶基因，而幾個 miRNAs 可以調(diào)節(jié)同一個基因。這種復(fù)雜的調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)既可以通過一個 miRNA 來經(jīng)濟(jì)地調(diào)控多個基因的表達(dá)，也可以通過幾個 miRNAs 的組合來精細(xì)調(diào)控某個基因的表達(dá)。對于基于 miRNA 調(diào)控基因表達(dá)的研究的逐步深入，將幫助我們理解高等真核生物的基因組的復(fù)雜性和復(fù)雜的基因表達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。

三、miRNA熒光定量PCR基本原理
實時熒光定量PCR技術(shù)是在PCR反應(yīng)體系中加入熒光試劑，利用熒光信號實時檢測PCR進(jìn)程，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進(jìn)行定量分析的方法。實時熒光定量PCR能夠?qū)Ｒ?、靈敏、快速、高重復(fù)性地精確定量起始模板濃度。但是就成熟的microRNA而言，由于其是由21-25個核苷酸組成的小RNA，長度太短，并不能通過傳統(tǒng)的實時定量PCR進(jìn)行檢測,但是通過特殊設(shè)計的莖環(huán)結(jié)構(gòu)的反轉(zhuǎn)錄引物，配合實時定量PCR引物及探針可以精確檢測微量樣品中microRNA表達(dá)水平，也可以用終點PCR法定性檢測。

雖然 microRNA 實時定量PCR是一種最近才發(fā)展起來的檢測技術(shù)，其技術(shù)細(xì)節(jié)還在不斷完善中,但是microRNA 實時定量PCR檢測系統(tǒng)，相對其它microRNA檢測技術(shù)有以下優(yōu)點：
1.高特異性 , 可以只對成熟 microRNA 進(jìn)行定量，有效區(qū)分成熟 microRNA 分子和前體分子以及其它成熟 microRNA 的同源分子；
2.快速，簡單，省時，整個操作只需兩步，不到 3 個小時，即可獲得高質(zhì)量的數(shù)據(jù)；
3.檢測靈敏度高，樣品消耗少，僅需 1-10ng 的總 RNA 或 50pg 左右的 microRNA ；
4.超寬的線性范圍，可跨越 7 個數(shù)量級；

四、miRNA序列在線查找
http://microrna./sequences/  

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