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什么是自噬？ 細胞自噬(autophagy or autophagocytosis)：又稱為Ⅱ型細胞死亡，是細胞在自噬相關(guān)基因(autophagyrelated gene，Atg)的調(diào)控下利用溶酶體降解自身受損的細胞器和大分子物質(zhì)的過程。 比利時科學家Christian de Duve在上世紀50年代經(jīng)過電鏡察看到自噬體（autophagosome）構(gòu)造，并且在1963年溶酶體國際會議上首先提出了'自噬'這種說法。因而Christian de Duve被公以為自噬研討的鼻祖。Christian de Duve也因發(fā)現(xiàn)溶酶體，于1974年取得諾貝爾獎。  目前根據(jù)發(fā)生過程分為三類：Macroautophagy，Microautophagy和Chaperone-mediated autophagy CMA)。 大自噬（Macroautophagy）即我們說的自噬（autophagy）; 微自噬（Microautophagy）：是指溶酶體主動、直接吞噬胞漿成分的一種方式; 分子伴侶介導的自噬(Chaperone-mediated autophagy，CMA)：一些分子伴侶，如hsp70，能幫助未折疊蛋白轉(zhuǎn)位入溶酶體。通常說的自噬泛指Macroautophagy. 自噬的過程 1）細胞接受自噬誘導信號后，在胞漿的某處形成一個小的類似'脂質(zhì)體'樣的膜結(jié)構(gòu)，然后不斷擴張，被稱為Phagophore。 2）Phagophore不斷延伸，將胞漿中的任何成分，全部攬入，然后'收口'，成為密閉的球狀的autophagosome，即'自噬體'。 3）自噬體形成后，可與細胞內(nèi)吞的吞噬泡、吞飲泡和內(nèi)體融合（這種情況不是必然要發(fā)生的）。 4）自噬體與溶酶體融合形成autolysosome，期間自噬體的內(nèi)膜被溶酶體酶降解，2者的內(nèi)容物合為一體，自噬體中的'貨物'也被降解，產(chǎn)物（氨基酸、脂肪酸等）被輸送到胞漿中，供細胞重新利用，而殘渣或被排出細胞外或滯留在胞漿中。  自噬的調(diào)控 1. 依賴mTOR（哺乳動物雷帕霉素靶點）途徑的自噬 1）PI3K-AKT-mTOR信號通路 2）AMPK-TSC 1/2-mTOR 信號通路 2. 其它的信號通路 1）3-甲基腺嘌呤（3-MA）通過抑制Class ⅢPI3K的活性抑制自噬。 2）beclin1和UVRAG作為正調(diào)控子，抗凋亡因子bcl-2作為負調(diào)控子共同參與組成Class ⅢPI3 復合物調(diào)控自噬。 3）GTP結(jié)合的G蛋白亞基Gαi3抑制自噬；GDP結(jié)合的Gαi3蛋白活化自噬。 4）死亡相關(guān)蛋白激酶（death-associated proteinlinase,DAPK）和DAPK相關(guān)蛋白激酶（DAPK-related protein kinase-1,DRP-1）誘導自噬。 5）PKA、casein激酶 Ⅱ、MAP激酶、calcium途徑也在自噬錯綜復雜的調(diào)控網(wǎng)格中，但其機制還不甚清楚。  自噬與疾病 1. 自噬與代謝 自噬能清除不正常構(gòu)型的蛋白質(zhì)，并消化受損和多余的細胞器，是真核細胞中廣泛存在的降解/再循環(huán)系統(tǒng)。 在細胞新陳代謝、結(jié)構(gòu)重建、生長發(fā)育中起著重要作用。 在饑餓和新生兒早期，自噬作用明顯加強，自噬體顯著增多。 2. 自噬與腫瘤 細胞自噬與腫瘤的關(guān)系十分復雜，目前尚未完全闡明。 一方面，正常細胞自噬增強，可表現(xiàn)出抑制腫瘤發(fā)生的功能；與此相反，抑制細胞自噬有潛在的致瘤可能。 另一方面，腫瘤細胞也可通過增強細胞自噬來對抗由缺氧、代謝產(chǎn)物、治療藥物誘導的應激反應。 細胞自噬研究 細胞自噬的研究是目前生物醫(yī)學領域熱點之一，廣泛參與各種生理和病理過程。目前普遍采用的自噬檢測方法包括電鏡、免疫熒光、蛋白質(zhì)印跡等方法檢測自噬體及其標志蛋白。 正常培養(yǎng)的細胞自噬活性很低，不適于觀察，因此，必須對自噬進行人工干預和調(diào)節(jié)，通常使用的工具藥有： 自噬誘導劑 (1) Bredeldin A / Thapsigargin / Tunicamycin ：模擬內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激 (2) Carbamazepine/ L-690，330/ Lithium Chloride（氯化鋰）：IMPase抑制劑（即Inositol monophosphatase，肌醇單磷酸酶） (3) Earle's平衡鹽溶液：制造饑餓 (4) N-Acetyl-D-sphingosine（C2-ceramide）：Class I PI3K Pathway抑制劑 (5) Rapamycin：mTOR抑制劑 (6) Xestospongin B/C：IP3R阻滯劑 自噬抑制劑 (1) 3-Methyladenine（3-MA）：（Class III PI3K）hVps34 抑制劑 (2) Bafilomycin A1：質(zhì)子泵抑制劑 (3) Hydroxychloroquine（羥氯喹）：Lysosomal lumen alkalizer（溶酶體腔堿化劑） 自噬過程的檢測 目前，人們對自噬的檢測主要包括基于檢測自噬體的直接(觀察自噬體的形態(tài))和間接(檢測自噬體表面蛋白標記)的方法以及基于自噬性降解原理設計的一些方法。除此之外，還可通過對自噬通路的調(diào)控來全面評價自噬功能對細胞行為或機體功能的影響，如自噬抑制或激活劑、自噬相關(guān)基因的敲除及沉默等。 除了電鏡下的形態(tài)學觀察外，自噬體標記蛋白LC3的檢測是目前常用的方法，在熒光顯微鏡下采用GFP-LC3融合蛋白來示蹤自噬形成，更有mRFP-GFP-LC3雙標蛋白的自噬檢測（詳細情況點此查看）等。 雙熒光LC3細胞自噬腺病毒  mRFP 用于標記及追蹤LC3，GFP 的減弱可指示溶酶體與自噬小體的融合形成自噬溶酶體，即由于GFP熒光蛋白對酸性敏感，當自噬體與溶酶體融合后GFP 熒光發(fā)生淬滅,此時只能檢測到紅色熒光。 我們在顯微鏡成像后紅綠熒光merge后通過merge后出現(xiàn)的黃色斑點即只是自噬體.紅色的斑點指示自噬溶酶體,通過不同顏色斑點的計數(shù)可以清晰的看出自噬流的強弱。 如下圖:細胞轉(zhuǎn)染mRFP-GFP-LC3病毒后給予氨基酸剝奪處理2小時后出現(xiàn)明顯增強的自噬以及自噬流。  紅色斑點是自噬溶酶體（mRFP），黃色斑點是自噬體（RFP+GFP）. 通過不同顏色斑點的計數(shù)可以清晰看出自噬流的強弱，實時監(jiān)測自噬發(fā)生過程，準確，清晰，直觀！ （自噬LC3雙標腺病毒由漢恒生物獨家提供） 研究的深入對自噬的檢測方法也提出了更高的要求，自噬功能障礙包括自噬體形成和降解障礙。因此，準確全面地評估自噬不僅包括自噬體的檢測，還包括動態(tài)觀察整個自噬性降解的過程是否順暢(即自噬潮分析)。 另外，通過藥物或基因干預技術(shù)來人為地調(diào)控自噬以觀察其在體內(nèi)體外模型中的作用也是自噬分析的重要內(nèi)容。需要注意的是，任何一種方法單獨應用均不能作為自噬的依據(jù)。對任何方法得到的結(jié)果進行解釋時必須慎重，特別是不能將自噬體的增多減少或自噬相關(guān)蛋白表達的高低等同于自噬的增強或減弱。
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