過去的幾十年里，生物制藥行業(yè)在細(xì)胞培養(yǎng)fed-batch（補(bǔ)料分批培養(yǎng)）實(shí)現(xiàn)高表達(dá)方面取得了巨大的進(jìn)步，形成了一整套完整的工藝開發(fā)和生產(chǎn)體系，其因操作相對(duì)簡(jiǎn)單，易于監(jiān)控和產(chǎn)品檢測(cè)和放行等特點(diǎn)，絕大多數(shù)企業(yè)均采用fed-batch作為其藥品生產(chǎn)的操作方式。

然而，現(xiàn)在一些公司開始開發(fā)連續(xù)流工藝培養(yǎng)模式，因?yàn)橄鄬?duì)于傳統(tǒng)的批次和補(bǔ)料批次培養(yǎng)方式，連續(xù)灌注培養(yǎng)生產(chǎn)能用更小的設(shè)備表達(dá)更多的產(chǎn)物，同時(shí)還能有效改善產(chǎn)品質(zhì)量。而且該培養(yǎng)模式中，補(bǔ)料營(yíng)養(yǎng)成分連續(xù)加入，有害代謝產(chǎn)物會(huì)及時(shí)去除，從而使得細(xì)胞在長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)維持高密度培養(yǎng)和活率。這樣不僅讓細(xì)胞處于平衡穩(wěn)定狀態(tài)，表達(dá)的產(chǎn)物具備高度一致性，尤其是敏感和不穩(wěn)定的分子而言，及時(shí)持續(xù)的從罐體從收獲純化蛋白能最大程度的保證產(chǎn)品的穩(wěn)定性。所以，當(dāng)反應(yīng)體系內(nèi)表達(dá)的是易降解或者半衰期很短的產(chǎn)品時(shí)，灌注的優(yōu)勢(shì)尤為明顯。同時(shí)，培養(yǎng)環(huán)境的優(yōu)化、體系的精確穩(wěn)定控制、細(xì)胞培養(yǎng)基的開發(fā)以及微膜過濾細(xì)胞截留設(shè)備的發(fā)展也進(jìn)一步推動(dòng)了連續(xù)灌注工藝的發(fā)展。

已經(jīng)有多個(gè)使用灌流工藝進(jìn)行培養(yǎng)的上市產(chǎn)品，如凝血因子（FVIII產(chǎn)品： Kogenate，拜耳； Refacto，輝瑞；FVII產(chǎn)品：Novoseven，諾和諾德）；Protein C（Xigris，禮萊）以及其他的酶制劑甚至包括一些單抗產(chǎn)品（Reopro和Remicade，強(qiáng)生； Simulect，諾華）。

目前，連續(xù)灌注培養(yǎng)方式主要有兩種，根據(jù)其在截留設(shè)備中的流體流動(dòng)方向分為切向流過濾（Tangential flow filtration，TFF）和交替切向流過濾（Alternative tangential filtration，ATF）。TFF中，細(xì)胞液通過泵的蠕動(dòng)作用形成一個(gè)連續(xù)的環(huán)形流動(dòng)方向，進(jìn)入纖維膜后，廢液會(huì)通過膜排出體系之外，細(xì)胞會(huì)隨著環(huán)路重新回到培養(yǎng)體系之內(nèi)。ATF是目前采用更多的一種方式，其通過隔膜泵的往復(fù)吹吸作用，實(shí)現(xiàn)罐體內(nèi)培養(yǎng)液在截留設(shè)備中的回路流動(dòng)，而液體中的代謝廢物，如乳酸、銨和一些代謝氨基酸，會(huì)通過膜排除體系之外，細(xì)胞重新回到罐體。另一方面，新鮮培養(yǎng)基會(huì)等量持續(xù)加入形成平衡，如表1和圖1所示。

表1 ATF和TFF對(duì)比

圖1 TFF和ATF的結(jié)構(gòu)示意圖

連續(xù)灌注培養(yǎng)分為濃縮分批補(bǔ)料和灌注培養(yǎng)兩種方式，其主要區(qū)別在于截留設(shè)備分子量的大小和目的產(chǎn)物的不同，其對(duì)比如表2所示。濃縮分批補(bǔ)料的主要目的是在相對(duì)短的時(shí)間內(nèi)，通過高細(xì)胞密度和活率的維持實(shí)現(xiàn)高表達(dá)，通常用于表達(dá)單克隆單抗這些穩(wěn)定蛋白的產(chǎn)品，它們不會(huì)隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加（20-30天）而出現(xiàn)降解等產(chǎn)品質(zhì)量方面的問題。對(duì)于灌注生產(chǎn)而言，目標(biāo)蛋白會(huì)持續(xù)通過截留設(shè)備流出到反應(yīng)體系之外，因此可以保證蛋白持續(xù)收獲純化，從而形成不同的“亞批次”，通常用于表達(dá)不穩(wěn)定的融合蛋白和細(xì)胞因子這些產(chǎn)品。如表2和圖2所示。

表2 濃縮分批補(bǔ)料和連續(xù)灌注培養(yǎng)

圖2 濃縮分批補(bǔ)料和連續(xù)灌注培養(yǎng)

不同于傳統(tǒng)的fed-batch培養(yǎng)定量加入濃縮補(bǔ)料，連續(xù)灌注培養(yǎng)需要精確的反應(yīng)體系控制，使之達(dá)到相對(duì)平衡的狀態(tài)，因此在實(shí)際工藝開發(fā)過程中，有諸多關(guān)鍵點(diǎn)需要解決，如表3。

表3 連續(xù)灌注培養(yǎng)關(guān)鍵點(diǎn)

從工藝角度看，30-60天（甚至更多）的培養(yǎng)需要更穩(wěn)定的細(xì)胞株，因此在早期克隆篩選中就需要考察細(xì)胞株的穩(wěn)定性（生長(zhǎng)、表達(dá)、基因拷貝數(shù)，以及產(chǎn)品質(zhì)量等方面），而不是在建立相應(yīng)細(xì)胞庫(kù)之后再做考察，否則會(huì)因?yàn)榧?xì)胞株自身的不穩(wěn)定造成質(zhì)量的一致性問題。連續(xù)灌注培養(yǎng)要求新鮮培養(yǎng)基的持續(xù)加入，因此培養(yǎng)基配制和儲(chǔ)存中的穩(wěn)定性尤為重要，因?yàn)槠鋾?huì)直接影響到營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)濃度的成分是否一致穩(wěn)定。從另一個(gè)角度，由于新鮮培養(yǎng)基的加入量通常為1-2vvd（每天加入的培養(yǎng)基體積），培養(yǎng)結(jié)束可高達(dá)30-120個(gè)體積，所以培養(yǎng)基成分的優(yōu)化必將能極大的縮減成本。同時(shí)補(bǔ)料、去除和過濾速率均會(huì)影響到反應(yīng)體系內(nèi)的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)是否處于相對(duì)平衡狀態(tài)。另外，如何在設(shè)備極限傳質(zhì)和混合條件下實(shí)現(xiàn)高密度細(xì)胞的連續(xù)穩(wěn)定培養(yǎng)液非常重要，實(shí)際工藝開發(fā)中需要摸索和調(diào)整目標(biāo)與控制條件的平衡。類似傳統(tǒng)的fed-batch培養(yǎng)，工藝參數(shù)的優(yōu)化也必不可少，其會(huì)影響到細(xì)胞活率的長(zhǎng)期維持狀態(tài)和蛋白質(zhì)量的一致性，例如降低溫度以維持活率以降低高密度狀態(tài)下對(duì)營(yíng)養(yǎng)成分的過度消耗。

從對(duì)培養(yǎng)環(huán)境的硬件要求來看，反應(yīng)器需要在長(zhǎng)時(shí)間的培養(yǎng)中維持極高的精確度和穩(wěn)定性，通氣盤的設(shè)計(jì)要能滿足細(xì)胞高氧傳質(zhì)系數(shù)的要求，又能及時(shí)的去除大量累積的CO2。目前，sparger（通氣盤）的設(shè)計(jì)主要分為macrosparger（大泡鼓泡通氣）和microsparger（微泡鼓泡通氣），或者通氣盤將兩者結(jié)合。Macrosparger的孔徑一般為0.5-1.0mm，microsparger的孔徑一般為10-20um和200-250um兩種，macrosparger由于產(chǎn)生的氣泡直徑較大，比表面積更小，所以KLa（傳質(zhì)系數(shù)）相對(duì)較低，雖然提高通氣量可以一定程度上提高KLa，但是效果有限，而且會(huì)對(duì)尾氣出氣造成潛在威脅，因此macrosparger孔徑以及孔的分布非常重要，它直徑影響到細(xì)胞代謝產(chǎn)生的CO2能否及時(shí)的從液體進(jìn)入氣泡而隨著上升帶出反應(yīng)體系，而不造成過高pCO2（CO2分壓）。從O2的傳質(zhì)來看，較小孔徑的microsparger能達(dá)到相對(duì)較高的KLa（>25h-1），但是過小的氣泡在上升過程中會(huì)裹挾大量細(xì)胞，當(dāng)達(dá)到頂層氣液表面后爆炸，此時(shí)產(chǎn)生的沖擊力將極大降低細(xì)胞活率。因此，并不是產(chǎn)生氣泡越小的microsparger越有利，雖然它能改善因高密度細(xì)胞帶來的傳質(zhì)需求，但我們得同時(shí)考慮到其表面氣速過高時(shí)對(duì)細(xì)胞的損傷。同樣，無論macrosparger還是microsparger，它們的傳質(zhì)效果與攪拌也關(guān)系密切。傳統(tǒng)細(xì)胞培養(yǎng)工藝認(rèn)為，哺乳動(dòng)物細(xì)胞耐受攪拌剪切力的能力有限，通常使用三葉斜葉作為首選，但是隨著人們對(duì)細(xì)胞尤其是CHO（中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞）的深入研究和馴化，現(xiàn)在一些細(xì)胞已經(jīng)能忍受相對(duì)較高的剪切力，所以一些情況下可考慮加入一個(gè)用于微生物培養(yǎng)的6葉槳，增加混合效果的同時(shí)也能提高傳質(zhì)效果，從另一個(gè)角度看，也能降低反應(yīng)體系通氣量的需求。細(xì)胞在相對(duì)高密度時(shí)比其低密度時(shí)對(duì)同樣轉(zhuǎn)速的剪切力耐受力更強(qiáng)，所以這不失為一個(gè)選擇的方案。

高密度下大量鼓泡氣體的進(jìn)入勢(shì)必會(huì)對(duì)培養(yǎng)體系的尾氣提出更高的挑戰(zhàn)，尤其是對(duì)于一次性反應(yīng)器而言，培養(yǎng)袋的耐壓能力和尾氣高通量非常重要，加配備用尾氣加熱和冷凝回流裝置將有效避免尾氣堵塞的風(fēng)險(xiǎn)。大規(guī)模培養(yǎng)時(shí)，使尾氣在進(jìn)入濾器之前充分加熱氣化然后進(jìn)入，這樣能避免因?yàn)闅怏w中夾帶的液體堵塞尾氣疏水性濾器，配置備份加熱套和濾器也應(yīng)考慮在內(nèi)。同樣，反應(yīng)器的攪拌混合和方式與整體氣體策略，以及尾氣出氣效率息息相關(guān)，能在保證低剪切力的前提下，最大程度的提高混合和傳質(zhì)效果，能減少因高密度培養(yǎng)袋來的極高通氣需求，進(jìn)一步降低對(duì)尾氣壓力的挑戰(zhàn)。因此，從這個(gè)層面上來看，細(xì)胞的培養(yǎng)環(huán)境在實(shí)際連續(xù)灌注培養(yǎng)中需要重點(diǎn)關(guān)注。

從系統(tǒng)控制角度來看，精確的反饋信號(hào)控制同樣不可忽視。目前，大多數(shù)在小試階段采用的仍然是定量補(bǔ)料和定量收獲，從而保持反應(yīng)體系的穩(wěn)定。由于玻璃罐體規(guī)模較小，這種相對(duì)粗放的方式容易控制，所以仍是可接受的一種方案。但是對(duì)于更大規(guī)模，比如百升甚至千升以上的反應(yīng)器而言，這樣簡(jiǎn)單的控制就顯得力不從心，做到絕對(duì)的等量補(bǔ)料和去除體積受到各種因素影響，因此精確而及時(shí)的反饋控制非常有必要。以反應(yīng)器的重量或者補(bǔ)料重量作為控制補(bǔ)料和去除體積的重量反饋控制指標(biāo)，可以有效控制反應(yīng)的穩(wěn)定性，使其處于相對(duì)平衡的狀態(tài)，降低了因其他不可控因素造成的補(bǔ)料和收獲量的不一致進(jìn)而引發(fā)的安全性問題。其控制方案如下所示。所以，從工藝開發(fā)放大的角度看，及時(shí)簡(jiǎn)單的工藝手段能夠完成小試階段開發(fā)的需求，但是仍需要掌握更精準(zhǔn)的反饋控制以提高放大的成功率。

圖3 連續(xù)灌注反應(yīng)器控制方式

Fed-batch中經(jīng)常使用葡萄糖濃度作為工藝開發(fā)中補(bǔ)料加入的基準(zhǔn)參數(shù)，除了氨基酸、脂類和維生素等，葡萄糖對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)和表達(dá)有著非比尋常的作用，它既是細(xì)胞能量代謝的來源，其代謝中間體也是糖基化作用的重要底物，所以葡萄糖濃度的平衡控制對(duì)最終產(chǎn)物質(zhì)量十分重要。從另一個(gè)角度看，如以葡萄糖濃度作為補(bǔ)料速率的indicator（指針），那必定將極大提高補(bǔ)料量的有效性，避免實(shí)際情況中因擔(dān)心營(yíng)養(yǎng)成分不夠而造成的過量補(bǔ)料，實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)控制，降低培養(yǎng)基的成本。另外，細(xì)胞達(dá)到PVCD（Peak viable cell density，最高活細(xì)胞密度）之后，設(shè)備的穩(wěn)定運(yùn)行面臨著極大的挑戰(zhàn)，如何使細(xì)胞維持較高的密度，又能保持相對(duì)可以接受的活率是工藝開發(fā)中需要解決的問題。如數(shù)據(jù)記錄軟件能實(shí)時(shí)收集運(yùn)行系統(tǒng)中的活細(xì)胞量，而不是傳統(tǒng)的離線取樣計(jì)數(shù)，那么據(jù)此可構(gòu)建補(bǔ)料或者去除細(xì)胞液的控制回路，將過量細(xì)胞及時(shí)從系統(tǒng)排除，同時(shí)維持設(shè)備極限下所能維持的最高密度，必將發(fā)揮灌注培養(yǎng)的最大優(yōu)勢(shì)。

從數(shù)據(jù)的收集和控制來看，長(zhǎng)時(shí)間的培養(yǎng)必然會(huì)產(chǎn)生大量的數(shù)據(jù)，如果只是簡(jiǎn)單的跟蹤幾個(gè)常見工藝控制數(shù)據(jù)，可能會(huì)導(dǎo)致對(duì)培養(yǎng)工藝?yán)斫獾钠?。因此，全面、?zhǔn)確而及時(shí)的實(shí)時(shí)捕獲培養(yǎng)過程中的所有數(shù)據(jù)十分重要。工藝優(yōu)化是一個(gè)持續(xù)改善的過程，我們需要對(duì)每個(gè)批次培養(yǎng)中的數(shù)據(jù)做一個(gè)全面分析，采用MVDA（Multivariate analysis，多變量分析）的方法找出各數(shù)據(jù)之間的深層次邏輯聯(lián)系和其對(duì)目標(biāo)的影響，然后結(jié)合DoE（Design of experiment，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)）的方法尋求穩(wěn)定可操作空間，使培養(yǎng)體系真實(shí)、穩(wěn)定、可靠。除此之外，對(duì)于批次運(yùn)行后的數(shù)據(jù)處理同樣不可忽視，傳統(tǒng)方法將表達(dá)量或質(zhì)量等結(jié)果與某一因素單一對(duì)應(yīng)進(jìn)行考察，但實(shí)際情況往往比這要更復(fù)雜，一個(gè)結(jié)果的出現(xiàn)由多種因素共同作用，所以需要對(duì)批次后數(shù)據(jù)進(jìn)行MVDA，找出多個(gè)變量如何影響最終結(jié)果，據(jù)此作出判斷優(yōu)化工藝生產(chǎn)。

截留設(shè)備與反應(yīng)系統(tǒng)的連接方式有很多種，對(duì)于玻璃罐而言，常見使用從頂蓋的diptube深入發(fā)酵液，與ATF或TFF構(gòu)成回路，對(duì)于不銹鋼或者一次性反應(yīng)器而言，包括T/C卡盤、無菌快接頭、OPTA無菌接頭以及無菌焊接等。根據(jù)截留設(shè)備大小的不同，選擇相應(yīng)尺寸，同時(shí)細(xì)胞在管路中受到的剪切力以及連接處的壓力承受能力都需要注意，有時(shí)會(huì)加上多個(gè)管路回路或者截留設(shè)備以降低細(xì)胞受到的剪切力和提高截留能力。

連續(xù)連培養(yǎng)作為一種新型技術(shù)極大的拓展了人們對(duì)工藝生產(chǎn)方式的理解，它解決了因蛋白質(zhì)量不穩(wěn)定或者表達(dá)量偏低，以及fed-batch無法保證批次穩(wěn)定控制等一系列問題，而且去除了中間一些不必要的放大步驟，簡(jiǎn)化了生產(chǎn)工藝。從法規(guī)層面來看，FDA成立Emerging Technology Team（應(yīng)對(duì)新型技術(shù)團(tuán)隊(duì)）對(duì)連續(xù)連生產(chǎn)持開放和支持的態(tài)度，他們認(rèn)定連續(xù)灌注是一項(xiàng)能帶來穩(wěn)定和更高效生產(chǎn)的技術(shù)。同時(shí)，由于其豐富的產(chǎn)品線，國(guó)內(nèi)一些大的生物制藥企業(yè)考也開始嘗試從傳統(tǒng)的fed-batch向連續(xù)生產(chǎn)轉(zhuǎn)變，以期解決傳統(tǒng)培養(yǎng)工藝無法真正滿足需求的問題。但與此同時(shí)，其特定的培養(yǎng)模式也面臨著一些挑戰(zhàn)，比如如何在長(zhǎng)時(shí)間的培養(yǎng)中防止染菌，驗(yàn)證從收獲到純化得到的各“亞批次”之間的一致性等，這些問題在企業(yè)快速申請(qǐng)IND時(shí)會(huì)顯得尤為重要。上述討論的工藝開發(fā)中的關(guān)鍵點(diǎn)看似相互分離，但實(shí)則牽一發(fā)而動(dòng)全身，實(shí)際過程中切不可只考慮到某一因素對(duì)結(jié)果的影響，而應(yīng)采用多變量分析的方法充分考慮不同變量之間的關(guān)系，以及綜合效應(yīng)對(duì)產(chǎn)物表達(dá)和質(zhì)量的影響。因此，要想實(shí)現(xiàn)連續(xù)生產(chǎn)還需要投入更多的時(shí)間和精力，才能將上游和下游真正的融合為一個(gè)整體，實(shí)現(xiàn)高質(zhì)量蛋白穩(wěn)定均一的表達(dá)和生產(chǎn)。

• MICHAEL SHERMAN V L, MELISSA CARPIO, NICK HUTCHINSON, AND CHRISTEL FENGE. Continuous Cell Culture operation at 2,000-L Scale [J]. BioProcess International, 2016, 14(10(s)): 22-8.

• KARST D, SERRA E, VILLIGER T, et al. Characterization and comparison of ATF and TFF in stirred bioreactors for continuous mammalian cell culture processes [J]. Biochemical Engineering Journal, 2016, 110(17-26.

• LIU BOA M S, JOHN DOERINGA, ERIKA LATTOVAB,HELENE PERREAULTB, MICHAEL BUTLERA,?. The availability of glucose to CHO cells affects the intracellular lipid-linked oligosaccharide distribution, site occupancy and the N-glycosylation profile of a monoclonal antibody [J]. Journal of Biotechnology, 2013, 1-11(17-27.

• CARINA VILLACR S V S T, ERIKA LATTOV , H L NE PERREAULT,  MICHAEL BUTLER1. Low glucose depletes glycan precursors, reduces site occupancy and galactosylation of a monoclonal antibody in CHO cell culture [J]. Biotechnol J, 2015, 10(1051-66.

• LEE S. Regulatory considerations for continuous pharmaceutical manufacturing processes [M]. Peking university continous manufacturing symposium. Beijing, China. 2016.

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