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Hi，VETMOOC的朋友們，想死你們了。前段時間一直想著大過年誰學(xué)習(xí)啊，不要逆流倒施跟大家過不去，這也算是年后第一篇，過年期間料肉比不知怎樣，日增重是勇創(chuàng)新高，過過年的才知道“每逢佳節(jié)胖三斤”那都是騙人的豈止是三啊。話說正月里面都是年，順祝大家新年快樂，減肥成功。 和ELISA的相處之道---動物疫病實驗室檢測與監(jiān)測技術(shù)（中） 前面兩期推文依次介紹了實驗室檢測技術(shù)的價值和意義，重點嘮了嘮血清學(xué)檢測利器ELISA的操作流程和老司機分享的“避坑指南”。今天繼續(xù)，把動物疫病實驗室檢測和監(jiān)測技術(shù)中的病原學(xué)檢測給介紹介紹。 仔細(xì)想想，疫病診斷的過程就像警察辦案抓壞人的過程，病原學(xué)的檢測就是使用各種生物學(xué)技術(shù)找到“壞人”留下的蛛絲馬跡，找到病原體本身，或是其構(gòu)成份（核酸、蛋白等），然后把證據(jù)坐實（確診）。在進(jìn)入到實驗室診斷之前，其實已經(jīng)有“警察”的現(xiàn)場辦案或?qū)嵉刈咴L的過程了——大致會有一個懷疑對象或是懷疑方向。農(nóng)場背景越清楚，疫病發(fā)生情況越了解，剖檢癥狀越典型，最后實驗室階段檢測的項目越少；反之，前面這個流程中獲得信息越少，發(fā)病越不典型，后期排查的內(nèi)容越多。
【PCR/RT-PCR 技術(shù)】 PCR 中文名是酶聚合鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase Chain Reaction），使用DNA聚合酶在特異性引物存在的情況下，以母鏈DNA為模板，通過堿基互補配對的方式，在體外合成子鏈DNA，是一個DNA體外合成，指數(shù)倍擴增放大DNA數(shù)量的過程。其以特定引物為延伸起點，通過變性——退火——延伸三個步驟多次循環(huán)（一般25-40個）完成。 由于PCR只能擴增DNA分子，如果病原是RNA病毒，想要進(jìn)行PCR就需要先進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，即將以RNA為模板使用反轉(zhuǎn)錄酶和下游引物（或隨機引物和oligodT）將而RNA反轉(zhuǎn)錄（RT）為互補cDNA，然后再以cDNA為模板進(jìn)行PCR，這就是RT/PCR 。 PCR能夠用于診斷檢測，其核心原理利用的就是已知的引物與待檢DNA模板之間的特異性匹配，例如一對檢測偽狂犬病病毒（PRV）的引物只和PRV的DNA產(chǎn)生火花（能夠特異性擴增），對圓環(huán)病毒（PCV2）的DNA是看不上眼，不會搭理的。 疫病檢測其優(yōu)點具體表現(xiàn)為客觀、快速、特異和敏感，若方法得當(dāng)還可用于區(qū)分一些病毒中的不同毒株。因此，目前它一直排在診斷實驗室病原診斷的第一位。但它的缺點一樣明顯，首先PCR檢測的是核酸，不管病原是死是活，PCR檢測到不一定代表還具有感染性，其次由于PCR非常敏感，而PCR產(chǎn)物中有含有海量的拷貝數(shù)，因此很容易由于污染造成假陽性，再者，由于是分子生物學(xué)反應(yīng)，加完樣品，設(shè)置好反應(yīng)程序基本就聽天由命，非常容易出現(xiàn)假陰性。 所以PCR在設(shè)計和操作過程中有一些需要非常注意的坑。 首先設(shè)計過程中，引物錨定的區(qū)域應(yīng)選擇毒株較為保守的區(qū)域，選拷轉(zhuǎn)錄過程中考貝數(shù)多的基因（比如PRRSV的ORF7N蛋白基因），對于有毒株間差異的個別位點可以使用簡并引物，提升引物的兼容性，同時要注意引物的特異性和區(qū)分性，不能和其他病原體，機體基因組有非特異性擴增。 PCR檢測過程中要注意試劑的冰上操作，減少上機前的非特異擴增，做好陰陽性對照，陽性對照要從核酸提取就加入，不能僅在PCR階段設(shè)置對照，這樣不能說明核酸提取和反轉(zhuǎn)錄（RT-PCR中）是否出現(xiàn)問題。引物應(yīng)避免反復(fù)凍融造成降解。在有非特異性條帶或抹帶時，可以嘗試降落（退火溫度遞減）PCR或兩步法PCR。
【Realtime PCR】 Realtime PCR技術(shù)是通過動態(tài)監(jiān)測PCR過程中的產(chǎn)物量，消除了產(chǎn)物堆積對定量分析的干擾，又叫作定量PCR。 --普通PCR由于有產(chǎn)物堆積無法精確定量-- 通常會用Taqman探針或者SBYR染料，因為反應(yīng)過程中機器是收集插入雙鏈DNA中SBYR染料或者是Taqman探針跟模板結(jié)合后放出的熒光信號，DNA越多，熒光信號越強，根據(jù)循環(huán)數(shù)和熒光強度建立線性關(guān)系去計算初始模板的量。所以又叫熒光定量PCR。 Realtime PCR中最重要的概念就是Ct值（每個反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號到達(dá)設(shè)定的域值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù))。復(fù)雜公式不講，在最疫病檢測的時候Ct值和病原核酸拷貝數(shù)是反著的，Ct值越低說明初始模板濃度越高。就好比都是達(dá)到一個億的小目標(biāo)，你本金越多，需要翻倍的次數(shù)越少，像作者這樣翻30-40個倍還不見起色的，就認(rèn)為是陰性了。 其特點在前面一篇文章中也提過： 敏感性更強，可根據(jù)Ct值初步判斷數(shù)量級，建標(biāo)準(zhǔn)曲線可精確定量，不用開蓋跑膠，省事，減少污染風(fēng)險。炫富炫技體現(xiàn)檢測者有錢高大上。缺點：貴，一般目標(biāo)片段較小，不方便直接測序，太敏感更容易污染。沒有電泳圖，Ct值跟核酸模板量成反比，比較不直觀。
【序列測定】 PCR條帶可能是非特異的擴增，需要測序驗證；基因測序可確診，可排除污染；測序確定毒株種類和親緣關(guān)系。 病毒常規(guī)測序基因:PRRSV：nsp2 和ORF5; CSFV： E2; PCV2： ORF2；豪友可以測全基因組（如果真要做重組分析只能這樣）。
【免疫熒光（IFA）】 IFA主要是利用抗原抗體反應(yīng)的特異性，在病原體和又它刺激產(chǎn)生的抗體之間知道其一測定另一個。 病毒接種易感細(xì)胞—>增殖培養(yǎng)—>固定接種后的細(xì)胞—>加特異性單（多）抗或臨床血清-->加熒光標(biāo)記抗體。
比如可以用于PRRSV分毒后的確診，也可以用已知PEDV接細(xì)胞后用來測血清是否有抗體。
【深度測序】 對于一些很難預(yù)判的病例或是可能的新病原體感染或是變異株感染，可以將用二代測序技術(shù)一股腦全測了，然后通過生物信息學(xué)技術(shù)比對看里面有什么算什么，一般根據(jù)read數(shù)來判斷誰可能是主要病原，再做常規(guī)PCR驗證。深度測序主要是在復(fù)雜和未知情況下尋找線索。最近華山報道的偽狂犬感染病例，還有蝙蝠當(dāng)中很多新病毒的發(fā)現(xiàn)都是用的這個技術(shù)。
【病毒分離】 將病料血清等感染材料接種病原體的易感細(xì)胞，分離病原體。這個多為科研目的，或是打的集團想分離自家病毒做馴化，其周期較長，不適合做快速診斷。 【Bioassay（易感動物感染）】 將病料血清接種易感動物，產(chǎn)生一些特異性的表現(xiàn)，比如如果有偽狂犬病毒，接種家兔后其表現(xiàn)出奇癢，也可以將陰性的哨兵動物放入豬群監(jiān)測哨兵動物的血清轉(zhuǎn)陽情況來評估豬群中是否在排毒。---這是科赫法則在臨床診斷中的一個實操，凈化過程常用。
如果想關(guān)注國外診斷實驗室如何操作的運行的，可以參考前面的一篇關(guān)于愛荷華州立大學(xué)獸醫(yī)診斷中心訪問的推文。 |
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