CRISPR基因編輯技術(shù)，自2013年被成功應(yīng)用于人類細(xì)胞以來，就被寄予攻克遺傳疾病的厚望，雖然不時(shí)有負(fù)面新聞出現(xiàn)，但是CRISPR基因編輯還是在疾病治療領(lǐng)域不斷取得突破，也已有多項(xiàng)CRISPR實(shí)驗(yàn)開始進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段。CRISPR基因治療的春天似乎就要到了。

2019年2月18日，最新上線的國(guó)際頂級(jí)醫(yī)學(xué)期刊 Nature Medicine 雜志同期發(fā)表了三篇論文，聚焦CRISPR/Cas9基因編輯在遺傳病領(lǐng)域的應(yīng)用。

這三篇論文使用CRISPR基因編輯技術(shù)，在早衰癥和杜氏肌營(yíng)養(yǎng)不良癥這兩種嚴(yán)重遺傳病治療中取得重大突破。其中兩篇各自獨(dú)立AAV9遞送的CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)提高了早衰癥小鼠約25%的壽命時(shí)間。第三篇使證實(shí)AAV8遞送的CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)可以修復(fù)杜氏肌營(yíng)養(yǎng)不良癥小鼠，單次注射能穩(wěn)定長(zhǎng)達(dá)1年的時(shí)間，且期間無毒性作用。

這三項(xiàng)研究分別來自：西班牙奧維耶多大學(xué)、美國(guó)索爾克生物研究所、美國(guó)杜克大學(xué)。

早年衰老綜合癥（Hutchinson-Gilford Progeria syndrome），簡(jiǎn)稱早衰癥。屬于先天性遺傳病，由于LMNA基因發(fā)生點(diǎn)突變所致，特點(diǎn)為發(fā)育延遲，至嬰兒時(shí)期就發(fā)生進(jìn)行性老年性退行性改變?；颊呱眢w的老化過程十分快速。而罹患此病孩童的年齡很少超過13歲，大約每八百萬個(gè)新生兒之中就有一到四人患有此疾，目前尚無有效治療方法。

杜氏肌營(yíng)養(yǎng)不良癥（Duchenne muscular dystrophy），簡(jiǎn)稱DMD，是一種X染色體隱性遺傳疾病，因此主要在男孩中發(fā)病。據(jù)統(tǒng)計(jì)，全球平均每3500個(gè)新生男嬰中就有一人罹患此病。患者一般在3-5歲開始發(fā)病，最早表現(xiàn)出進(jìn)行性腿部肌無力，導(dǎo)致不便行走。12歲時(shí)失去行走能力，20歲-30歲因呼吸衰竭而死亡。

1、為早衰癥開發(fā)的一種基于CRISPR/Cas9的基因療

論文題目：Development of a CRISPR/Cas9-based therapy for Hutchinson–Gilford progeria syndrome.

核結(jié)構(gòu)蛋白lamin A和C是由LMNA基因編碼，在早衰癥中，LMNA基因發(fā)生突變，激活了一個(gè)選擇性前體mRNA （pre-mRNA）剪接位點(diǎn)，導(dǎo)致表達(dá)一種缺失50個(gè)氨基酸的lamin A蛋白突變體——progerin，progerin累積于核膜上，Progerin以一種顯性方式發(fā)揮作用，可導(dǎo)致多種細(xì)胞缺陷，損害核結(jié)構(gòu)的完整性、異染色質(zhì)維持、DNA修復(fù)和氧化還原穩(wěn)態(tài)，從而促進(jìn)細(xì)胞衰老。

CRISPR/Cas9基因編輯工具在之前的研究中對(duì)杜氏肌營(yíng)養(yǎng)不良、代謝病以及先天性失明、失聰?shù)燃膊‘a(chǎn)生了非常有希望的療效。之前的小鼠實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，同時(shí)有正常lamin A蛋白和突變的progerin蛋白的小鼠表型正常。因此，減少異常剪接導(dǎo)致的progerin蛋白的積累，就有望治愈早衰癥。

研究人員開發(fā)了針對(duì)早衰癥的基于CRISPR / Cas9的策略，旨在阻斷lamin A蛋白和progerin的積累。LMNA基因通過可變剪接和多腺苷酸化編碼lamin C（由外顯子1-10編碼）和lamin A（由外顯子1-12編碼）。由于lamin A可有可無的，因此該策略是破壞LMNA基因的最后部分，阻礙laminA / progerin的產(chǎn)生，而不影響lamin C。

該研究使用早衰癥小鼠模型，考慮到安全性和廣泛的組織親和性，選擇了腺相關(guān)病毒9型（AAV9）作為遞送載體。每只實(shí)驗(yàn)小鼠通過腹腔注射2×10的11次方的AAV9，RT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)progerin的mRNA降低到檢測(cè)不到的水平，免疫組化實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)progerin蛋白陽(yáng)性的細(xì)胞顯著減少。

重要的是，與對(duì)照小鼠相比，經(jīng)過CRISPR/Cas9治療的小鼠中的progerin蛋白顯著減少，其中位存活時(shí)間增加了33.5天，從127天增加到160.5天，這代表了26.4％的壽命增長(zhǎng)。最大生存期從151天延長(zhǎng)到212天。

2、單劑量CRISPR/Cas9療法延長(zhǎng)了早衰癥小鼠的壽命

論文題目：Single-dose CRISPR–Cas9 therapy extends lifespan of mice with Hutchinson–Gilford progeria syndrome.

該研究的原理和方法與上一項(xiàng)研究類似，靶向基因和位點(diǎn)也相同，同樣使用AAV9型遞送載體，此處不再贅述。不同之處在于，考慮到早衰癥是一種全身性疾病，該研究使用靜脈注射方式給藥。而且，同時(shí)使用雙靶點(diǎn)gRNA靶向LMNA基因的11、12號(hào)外顯子。

從實(shí)驗(yàn)結(jié)果來看，CRISPR/Cas9基因治療減緩了早衰癥小鼠的體重減輕情況。與對(duì)照組小鼠相比，基因治療組的小鼠中位存活時(shí)間從16.7周提高到25.3周，這代表了約25%的壽命延長(zhǎng)。

3、對(duì)杜氏肌營(yíng)養(yǎng)不良癥的AAV-CRISPR基因組編輯的長(zhǎng)期評(píng)估

論文題目：Long-term evaluation of AAV-CRISPR genome editing for Duchenne muscular dystrophy.

杜氏肌營(yíng)養(yǎng)不良癥（DMD）是一種發(fā)病率相對(duì)較高的單基因疾病，由X染色體上編碼抗肌萎縮蛋白基因（dystrophin）突變所致，是治療性基因組編輯的熱門候選者。最近有幾個(gè)在DMD的臨床前模型中進(jìn)行基因組編輯的研究報(bào)道，然而，這些基因組編輯方法的長(zhǎng)期持久性和安全性尚未得到解決。

由于dystrophin基因很巨大，有多達(dá)79個(gè)外顯子，因此直接遞送正確編碼的dystrophin基因的治療方式行不通。該研究使用CRISPR/Cas9基因編輯，直接刪除突變位點(diǎn)附近的堿基，產(chǎn)生縮短版的抗肌萎縮蛋白，依然可以恢復(fù)部分肌肉能力。

本項(xiàng)研究顯示，通過靜脈單次注射AAV8裝載的CRISPR后，基因組編輯效果在肌營(yíng)養(yǎng)不良癥的小鼠模型中可持續(xù)長(zhǎng)達(dá)1年的時(shí)間。此外，在此期間抗肌萎縮蛋白表達(dá)的恢復(fù)得以維持。

這項(xiàng)研究還表明AAV-CRISPR在給予成年小鼠治療時(shí)具有免疫原性，然而，通過治療新生小鼠可以避免體液和細(xì)胞免疫反應(yīng)。盡管存在對(duì)Cas9的宿主反應(yīng)和持續(xù)的非預(yù)期的基因組修飾，但AAV-CRISPR具有良好的耐受性，長(zhǎng)達(dá)1年時(shí)間，且沒有毒性跡象。

關(guān)于Cas9的免疫反應(yīng)，點(diǎn)擊查看：波瀾再起：人體預(yù)先存在對(duì)Cas9蛋白的免疫反應(yīng)

該研究進(jìn)一步確定了永久性基因校正作為DMD和潛在其他疾病的治療方法的可行性。未來的研究應(yīng)側(cè)重于通過優(yōu)化遞送和基因編輯策略來提高整體編輯效率和增加預(yù)期基因修飾的比例（減少脫靶效應(yīng)）。

論文鏈接：

https://www./articles/s41591-018-0338-6

https://www./articles/s41591-019-0343-4

https://www./articles/s41591-019-0344-3