【摘要】 目的探討曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)(open field test，OFT)和明暗箱實(shí)驗(yàn)(1ight．dark box。LDB)作為昆明小鼠狀態(tài)焦慮動(dòng)物模型的相關(guān)性。方法20只成年雄性昆明小鼠先后放入曠場(chǎng)敞箱和明暗穿梭箱，攝像系統(tǒng)記錄5 min的行為變化。實(shí)驗(yàn)間隔l周，實(shí)驗(yàn)參數(shù)如下：OFT中央?yún)^(qū)停留時(shí)間百分率(OFT-Ctime％)、中央?yún)^(qū)水平運(yùn)動(dòng)百分率(OFT-Ccress％)、總水平運(yùn)動(dòng)得分(OFT—Cross)、總垂直運(yùn)動(dòng)得分(OFT-Rear)和糞便粒數(shù)得分(OFT-FB)，LDB明區(qū)停留時(shí)間百分率(LDB—Ltime％)、明區(qū)水平運(yùn)動(dòng)百分率(LDB·Lcress％)、明區(qū)垂直運(yùn)動(dòng)百分率(LDB—hea揚(yáng))、穿梭次數(shù)得分(LDB-Transition)、總水平運(yùn)動(dòng)得分(LDB-Cross)、總垂直運(yùn)動(dòng)得分(LDB-Rear)和糞便粒數(shù)得分(LDB—FB)；采用因子分析、聚類(lèi)分析和相關(guān)分析統(tǒng)計(jì)方法進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。結(jié)果①因子分析和聚類(lèi)分析提示，OFT／LDB獨(dú)立評(píng)價(jià)時(shí)具有相似3維結(jié)構(gòu)：OFI'／LDB焦慮因子、OFT／LDB活性因子和OFT／LDB情緒因子；OFT·LDB合并評(píng)價(jià)時(shí)則為五維結(jié)構(gòu)：LDB焦慮因子、OFT焦慮因子、LDB活性因子、OFT-LDB情緒因子和OFT活性因子。②相關(guān)分析提示。OFT情緒因子與LDB情緒因子具有較好相關(guān)性(Pearson=0．383，P<0．05)；LDB焦慮因子與LDB焦慮因子(Pearson=0．989，P<0．01)，OFT焦慮因子與OFT焦慮因子(Pearson=0．934，P<0．01)，LDB焦慮因子與LDB焦慮因子(Pearson=0．956。P<0．01)，O剛LDB情緒因子與OFTLDB情緒因子(Pearson=0．835，P<0．01；Pearson=0．696，P<0．01)。OFT活性因子與OFT活性因子(Pearson=O．926，P<0．01)具有較好相關(guān)性。結(jié)論OFT／LDB獨(dú)立評(píng)價(jià)時(shí)具有相似三維結(jié)構(gòu)，而OFT-LDB合并評(píng)價(jià)時(shí)則為5維結(jié)構(gòu)：僅OFT／LDB情緒因子可以合并。因此，在以“行為組學(xué)”聯(lián)合評(píng)價(jià)時(shí)，各維度并非一一對(duì)應(yīng)，應(yīng)注意動(dòng)物模型異質(zhì)性問(wèn)題。

【關(guān)鍵詞】曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)；明暗箱實(shí)驗(yàn)；動(dòng)物模型；狀態(tài)焦慮；相關(guān)性；昆明小鼠

曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)(open field test，OFT)和明暗箱實(shí)驗(yàn)(1ight．dark box，LDB)是評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物焦慮情緒與運(yùn)動(dòng)功能的經(jīng)典方法，廣泛應(yīng)用于精神神經(jīng)藥理學(xué)的基礎(chǔ)研究。前期基礎(chǔ)研究發(fā)現(xiàn)，OFT和LDB具有相似的三維結(jié)構(gòu)：焦慮因子維度，活性因子維度和情緒因子維度。盡管越來(lái)越多的基礎(chǔ)研究?jī)A向于聯(lián)合多種動(dòng)物模型進(jìn)行“行為組學(xué)”評(píng)價(jià)，但其評(píng)價(jià)結(jié)果往往又不盡一致，從而消弱了最終評(píng)價(jià)結(jié)果的可信度。本研究綜合采用因子分析、聚類(lèi)分析和相關(guān)分析多種統(tǒng)計(jì)方法，以初步探討昆明小鼠狀態(tài)焦慮動(dòng)物模型的相關(guān)性：OFT與LDB具有相似的三維結(jié)構(gòu)，各維度是否一一對(duì)應(yīng)，所反映的焦慮狀態(tài)是否同質(zhì)?

材料與方法

一、材料

1．實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：昆明小鼠，雄性，由山東中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供(許可證號(hào)：SCXK(魯)20050015)。室溫(20±2)℃，光照12h(6：00—18：00)和黑暗12h(18：00—6：00)環(huán)境，自由進(jìn)水飲食飼養(yǎng)；預(yù)適應(yīng)環(huán)境1周后，選取體質(zhì)量(25±1)g小鼠20只進(jìn)入正式實(shí)驗(yàn)(所有實(shí)驗(yàn)均于19：00—24：00進(jìn)行)。

2．實(shí)驗(yàn)裝置：曠場(chǎng)敞箱：尺寸內(nèi)徑(50cm×50cm×40cm)，周壁及底面均為灰色，底面用配套軟件在電腦上劃分為面積相等的25個(gè)方格(10cm×10cm)；其中沿墻壁方格稱(chēng)外周格，其余方格稱(chēng)中央格。明暗穿梭箱：尺寸內(nèi)徑(27cm×27cm×30cm)，明箱、暗箱尺寸一致。該儀器以及配套軟件均由上海欣軟信息科技有限公司提供。

二、方法

l-OFT：操作者將小鼠小心放入曠場(chǎng)敞箱正中格，用攝像系統(tǒng)記錄動(dòng)物5min的行為變化，其中納入OFT實(shí)驗(yàn)參數(shù)有：中央?yún)^(qū)停留時(shí)間百分率(OFTCrime％)、中央?yún)^(qū)水平運(yùn)動(dòng)百分率(OFT-Ccrosa％)、總水平運(yùn)動(dòng)得分(OFT．Cross)、總垂直運(yùn)動(dòng)得分(OFTRear)和糞便粒數(shù)得分(OFT-FB)。

2．LDB：操作者將小鼠放入明暗穿梭箱，用攝像系統(tǒng)記錄動(dòng)物5min的行為變化，其中納入LDB實(shí)驗(yàn)參數(shù)有：明區(qū)停留時(shí)間百分率(LDB—Ltime％)、明區(qū)水平運(yùn)動(dòng)百分率(LDB．Lcross％)、明區(qū)垂直運(yùn)動(dòng)百分率(100％，LDB—Lrear％)、穿梭次數(shù)得分(LDB—Tran—sition)、總水平運(yùn)動(dòng)得分(LDB—Cross)、總垂直運(yùn)動(dòng)得分(LDB—Rear)和糞便粒數(shù)得分(LDB．FB)。

3．實(shí)驗(yàn)操作：實(shí)驗(yàn)先進(jìn)行OFT，間隔1周再進(jìn)行LDB；實(shí)驗(yàn)環(huán)境由30w紅色白熾燈提供照明；每只動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)束后清除糞便，用70％乙醇噴灑箱底并用潔凈紗布抹干，以免前一只動(dòng)物的殘留氣味造成對(duì)本次實(shí)驗(yàn)的影響；全部實(shí)驗(yàn)結(jié)束后由不熟悉實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)人員進(jìn)行數(shù)據(jù)人工提取與錄入。

4．統(tǒng)計(jì)分析：采用SPSS 13.0 for Windows 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析：因子分析由Analyze-DataReduction-FactorAnalysis過(guò)程完成，以Principal components提取公因子，以累計(jì)貢獻(xiàn)率>85％作為因子納入標(biāo)準(zhǔn)，采用Varimax正交旋轉(zhuǎn)；聚類(lèi)分析參數(shù)由Analyze-Classify-HierarchicalCluster Analysis過(guò)程完成，采用R型變量聚類(lèi)，選擇Between-groupslinkage測(cè)量方法和PearsonCorrelation距離類(lèi)型；相關(guān)分析由Analyze-Cotrelate-Bivariate Correlations過(guò)程完成，所有數(shù)據(jù)先進(jìn)行Kolmogorov-Smimov正態(tài)分布檢驗(yàn)。以P<0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、因子分析評(píng)價(jià)OFT與LDB相關(guān)性

1．KMO和Bartlett球形檢驗(yàn)：不管獨(dú)立(OFT／LDB)還是合并(OFT—LDB)評(píng)價(jià)，實(shí)驗(yàn)參數(shù)間相關(guān)性尚可，適合進(jìn)行因子分析(KMO=0．598，X2=43．884，P<0．01：KMO=0．573，x2=102．470．P<0．01；KMO=0．527，x2=173．957，P<0．01)。

2．OFT／LDB獨(dú)立因子分析：OFT／LDB具有相似的三維結(jié)構(gòu)：OFT／LDB焦慮因子、OFT／LDB活性因子和OFT／LDB情緒因子。見(jiàn)圖1。

3．OFT-LDB合并因子分析：OFT-LDB具有五維結(jié)構(gòu)：’LDB焦慮因子、’OFr焦慮因子、’LDB活性因子、’OFT．LDB情緒因子及’OFT活性因子。見(jiàn)圖2。

二、聚類(lèi)分析評(píng)價(jià)OFT與LDB相關(guān)性

1．OFT獨(dú)立聚類(lèi)分析：OFT實(shí)驗(yàn)參數(shù)可分為三類(lèi)：OFT．Ctime％、OFT．Ccross％第一類(lèi)，OFT-Cross、OFT—Rear第二類(lèi)，OFI'-FB第三類(lèi)。

2．LDB獨(dú)立聚類(lèi)分析：LDB實(shí)驗(yàn)參數(shù)可分三類(lèi)：

LDB-Ltime％、LDB-Lcross％、LDB-Lrear％第一類(lèi)，LDB—Transition、LDB-Cross、LDB．Rear第二類(lèi)，LDB-FB第三類(lèi)。

3．OFT-LDB合并聚類(lèi)分析：OFT-LDB實(shí)驗(yàn)參數(shù)可合并為五類(lèi)：OFT-Ctime％、OFT-Ccross％第一類(lèi)，LDB．Ltime％、LDB-Lcross％、LDB-Lrear％第二類(lèi)，OFTrCross、OVI'一Rear第三類(lèi)，LDB—Transition、LDB-Cross、LDB-Rear第四類(lèi)，oFr．FB、LDB-FB第五類(lèi)。

三、OFT與LDB相關(guān)性分析

1．正態(tài)性分布：Kolmogorov-Smirnov正態(tài)分布檢驗(yàn)提示，所有實(shí)驗(yàn)參數(shù)和因子均符合正態(tài)分布，故采用Pearson相關(guān)分析。

2．OFT／LDB實(shí)驗(yàn)參數(shù)相關(guān)性：OFT-Cross與LDB·Transition，OFT-Rear與LDB·Ltime％、LDB．Lcross、LDBI．,rear％、LDB．Transition，OFT．FB與LDB．FB均具有較好相關(guān)性。

3．OFT／LDB獨(dú)立因子相關(guān)性：OFF情緒因子與LDB情緒因子具有較好相關(guān)性，說(shuō)明OFrI'、LDB聯(lián)合評(píng)價(jià)時(shí)情緒因子合并的合理性，并提示OFT和LDB在聯(lián)合評(píng)價(jià)動(dòng)物模型焦慮狀態(tài)和運(yùn)動(dòng)探索活性時(shí)存在異質(zhì)性問(wèn)題。

4．OFT／LDB獨(dú)立因子與OFT—LDB合并因子相關(guān)性：LDB焦慮因子與’LDB焦慮因子，OFT焦慮因子與’OFF焦慮因子，LDB活性因子與’LDB活性因子，OFT／LDB情緒因子與’OFTr—LDB情緒因子，OFT活性因子與OFT活性因子均具有較好相關(guān)性，進(jìn)一步說(shuō)明OFT／LDB獨(dú)立因子與OFT-LDB合并因子的相關(guān)性以及OFT／LDB情緒因子合并的合理性。

討 論

OFT是由Hall于1934年最先提出用于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物行為學(xué)評(píng)價(jià)，其最初主要通過(guò)FB這一參數(shù)來(lái)評(píng)價(jià)嚙齒類(lèi)情緒反應(yīng)，后來(lái)逐漸擴(kuò)展Cross(與FB成負(fù)相關(guān))、Rear(與Cross成正相關(guān))以及其他實(shí)驗(yàn)參數(shù)。關(guān)于OFT結(jié)構(gòu)效度研究，Denenberg等與Whimbey等曾提出OFT具有二維結(jié)構(gòu)：OFT活性(運(yùn)動(dòng))因子維度(Cross)和情緒因子維度(FB)；Royce也曾提出OFF具有三維結(jié)構(gòu)：運(yùn)動(dòng)量維度(運(yùn)動(dòng)潛伏期、Cross和穿越中央格)、自律性平衡維度(FB)和領(lǐng)地性標(biāo)記維度(排尿)。

LDB是由Crawley于1980年最先提出作為動(dòng)物模型來(lái)評(píng)價(jià)抗焦慮藥物的藥理效應(yīng)，其最初主要通過(guò)Transition、Cross和Rear這三個(gè)參數(shù)來(lái)評(píng)價(jià)嚙齒類(lèi)焦慮行為。關(guān)于LDB結(jié)構(gòu)效度研究，Costall和Belzung提出Transition參數(shù)具有習(xí)慣化效應(yīng)，實(shí)際上更傾向于評(píng)價(jià)探索行為； Shimada提出把Ltime％、Lcross％和Lrear％作為評(píng)價(jià)抗焦慮藥物在LDB動(dòng)物模型的效應(yīng)參數(shù)，尤其是Lfime％具有濃度依賴(lài)性；而LapinIP更甚至提出把“走出暗箱頻率”作為評(píng)價(jià)致焦慮劑在LDB動(dòng)物模型的唯一穩(wěn)定參數(shù)。

本研究結(jié)果提示，OFF—Rear與LDB焦慮因子維度參數(shù)成較好負(fù)相關(guān)，LDB-Transition與OFF活性因子維度參數(shù)成較好正相關(guān)，OFF與LDB情緒因子維度及其參數(shù)FB成較好正相關(guān)。盡管OFF和LDB具有相似的三維結(jié)構(gòu)，但是其產(chǎn)生焦慮行為的矛盾沖突并不一致：OFF是利用動(dòng)物對(duì)新奇環(huán)境的探究習(xí)性與對(duì)空曠場(chǎng)地危險(xiǎn)性的矛盾沖突，LDB則是利用動(dòng)物對(duì)新奇環(huán)境的探究習(xí)性與對(duì)強(qiáng)光線(xiàn)厭惡感的矛盾沖突；而FB所反映的情緒因子維度則基本一致：共同源于動(dòng)物自主神經(jīng)系統(tǒng)活性升高。故在以“行為組學(xué)”形式聯(lián)合評(píng)價(jià)時(shí)則可合并為五維結(jié)構(gòu)，提示OFF與LDB作為動(dòng)物模型在反映焦慮狀態(tài)和運(yùn)動(dòng)探索活性方面存在異質(zhì)性，而在反映情緒因子維度方面存在同源性。

綜上所述：①OFF／LDB具有相似的三維結(jié)構(gòu)：焦慮因子維度、活性因子維度和情緒因子維度；@oFF與LDB三維結(jié)構(gòu)并非一一對(duì)應(yīng)，聯(lián)合評(píng)價(jià)時(shí)僅情緒因子維度可以合并；③OFT與LDB作為動(dòng)物模型在評(píng)價(jià)焦慮狀態(tài)和運(yùn)動(dòng)探索活性方面存在異質(zhì)性，而在評(píng)價(jià)情緒活性方面存在同源性；④“行為組學(xué)”綜合評(píng)價(jià)抗焦慮藥物藥理效應(yīng)時(shí)應(yīng)注意動(dòng)物模型異質(zhì)性問(wèn)題，同時(shí)也期待新的動(dòng)物模型及評(píng)價(jià)方法的建立。

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