3.3 SYBR@Green 法

SYBR@Green I是一種結(jié)合于小溝中的雙鏈DNA結(jié)合染料，與雙鏈DNA結(jié)合后，其熒光大大增強。這一性質(zhì)使其用于擴增產(chǎn)物的檢測非常理想。SYBR@Green I 的最大吸收波長約為497nm，發(fā)射波長最大約為520nm。在PCR反應(yīng)體系中，加入過量SYBR@Green 熒光染料，SYBR@Green 熒光染料特異性地?fù)饺隓NA雙鏈后，發(fā)射熒光信號，而不摻入鏈中的SYBR@Green 染料分子不會發(fā)射任何熒光信號，從而保證熒光信號的增加與PCR產(chǎn)物的增加完全同步。

3.4 LUX@Primers法

LUX@ (light upon extention) 引物是利用熒光標(biāo)記的引物實現(xiàn)定量的一項新技術(shù)。目標(biāo)特異的引物對中的一個引物3’端用熒光報告基團標(biāo)記。在沒有單鏈模板的情況下，該引物自身配對，形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，使熒光淬滅。在有目標(biāo)片斷的時候，引物與模板配對，發(fā)夾結(jié)構(gòu)打開，產(chǎn)生特異的熒光信號。

4. Real-time qPCR和常規(guī)PCR的區(qū)別

實時檢測（在對數(shù)擴增時期）而不是終點檢測

敏感性高

需要樣品少

特異性高

精確定量

三、Real-time qPCR實驗設(shè)計

實驗設(shè)計其實比實驗本身更重要！好的實驗設(shè)計可以事半功倍，節(jié)省時間！尤其做生物實驗，一定要查詢盡可能完全的相關(guān)資料，整理好思路，設(shè)計好實驗路線。當(dāng)然實驗過程中出現(xiàn)各種各樣的變化，但有足夠多的背景知識，就可以分析原因，才有可能創(chuàng)新。對于一個real-time qPCR而言，首先就是實驗材料的處理和準(zhǔn)備；然后引物設(shè)計，這步至關(guān)重要，好的引物是實驗本身成功的50%；進行實驗和數(shù)據(jù)分析（這一部分單獨說明）。

1. 實驗材料的處理和準(zhǔn)備

以最基本的基因表達(dá)差異分析為例。實驗材料分為對照組（CON）和處理組（TRT）。組內(nèi)要有生物重復(fù)，可以數(shù)據(jù)分析此處理是否有統(tǒng)計意義。在材料收集過程中，盡量避免RNA的降解（尤其對于絕對定量的樣品）。

一般傳統(tǒng)的收集材料的方法是樣品采集立刻液氮速凍，然后迅速轉(zhuǎn)移到超低溫冰箱保存，但這種方法攜帶不方便，由于對于異地取材。現(xiàn)在新技術(shù)的發(fā)展，也有一些非液氮類的樣品儲存液 ，比如百泰克的RNAfixer 。

2. 引物設(shè)計

一般real-time PCR引物的設(shè)計遵循下面一些原則：

擴增產(chǎn)物長度在80-150bp。

引物應(yīng)用核酸系列保守區(qū)內(nèi)設(shè)計并具有特異性。

產(chǎn)物不能形成二級結(jié)構(gòu)。

產(chǎn)物長度一般在15-30堿基之間。

G+C含量在40%-60%之間。

堿基要隨機分布。

引物自身不能有連續(xù)4個堿基的互補。

引物之間不能有連續(xù)4個堿基的互補。

引物5’端可以修飾。

引物3’端不可修飾。

引物3’端要避開密碼子的第3位。

Taqman@探針的設(shè)計稍有不同，一般有公司設(shè)計合成。遵循下面以下原則：

盡量靠在上游引物；

長度30-45bp，Tm比引物高至少5℃；

5’端不要是G，G會有淬滅作用，影響定量

四、Real-time qPCR操作過程

1. RNA提取和反轉(zhuǎn)錄

在抽提RNA過程中任一環(huán)節(jié)的不正確操作都可能導(dǎo)致RNA酶的污染。由于RNA酶的活性很難完全抑制，預(yù)防其污染是十分必要的。在實際的操作中應(yīng)遵循下面一些原則：

（1）全程佩戴一次性手套。皮膚經(jīng)常帶有細(xì)菌和霉菌，可能污染RNA的抽提并成為RNA酶的來源。培養(yǎng)良好的微生物實驗操作習(xí)慣預(yù)防微生物污染。

（2）使用滅菌的，一次性的塑料器皿和自動吸管抽提RNA，避免使用公共儀器所導(dǎo)致的RNA酶交叉污染。例如，使用RNA探針的實驗室可能用RNA酶A或T1來降低濾紙上的背景，因而某些非一次性的物品（如自動吸管）可能富含RNA酶。

（3）在提取裂解液中，RNA是隔離在RNA酶污染之外的。而對樣品的后續(xù)操作會要求用無RNA酶的非一次性的玻璃器皿或塑料器皿。玻璃器皿可以在150°C的烘箱中烘烤4小時。塑料器皿可以在0.5M NaOH中浸泡10分鐘，用水徹底漂洗干凈后高壓滅菌備用。

當(dāng)然，這些也不是絕對的要求。如果是操作熟練。完全可以用初次開封的離心管和槍頭，新過濾的超純水，進行RNA的提取。

2. Mix配制

一般來講，進行real-time qPCR MasterMix都是2×的濃縮液，只需要加入模板和引物就可以。

由于real-time qPCR靈敏度高，所以每個樣品至少要做3個平行孔，以防在后面的數(shù)據(jù)分析中，由于Ct相差較多或者SD太大，無法進行統(tǒng)計分析。通常來講，反應(yīng)體系的引物終濃度為100-400mM；模板如果是總RNA一般是10ng-500，如果cDNA，通常情況下是1ul或者1ul的10倍稀釋液，要根據(jù)目的基因的表達(dá)豐度進行調(diào)整。當(dāng)然這些都是經(jīng)驗值，在操作過程中，還需要根據(jù)所用MasterMix，模板和引物的不同進行優(yōu)化，達(dá)到一個最佳反應(yīng)體系。在反應(yīng)體系配置過程中，有下面幾點需要注意：

（1）MasterMix不要反復(fù)凍融，如果經(jīng)常使用，最好溶解后放在4度。

（2）更多的配制Mix進行，減少加樣誤差。最好能在冰上操作。

（3）每管或每孔都要換新槍頭！不要連續(xù)用同一個槍頭加樣！

（4）所有成分加完后，離心去除氣泡。

（5）每個樣品至少3個平行孔。

參比或者校正染料（reference dye，passive dye）常用的是ROXTM（現(xiàn)在已經(jīng)是ABI的注冊商標(biāo)了！）或者其他染料，只要不影響檢測PCR產(chǎn)物的熒光值就可以。

參比染料的作用是標(biāo)準(zhǔn)化熒光定量反應(yīng)中的非PCR震蕩，校正加樣誤差或者是孔與孔之間的誤差，提供一個穩(wěn)定的基線?，F(xiàn)在很多公司已經(jīng)把ROXTM配制在MasterMix或者Premixture里。如果反應(yīng)曲線良好或已經(jīng)優(yōu)化好反應(yīng)體系，也可以不加ROXTM染料校正。

通常來講，real-time qPCR的反應(yīng)程序不需要像常規(guī)的PCR那樣，要變性、退火、延伸3步。由于其產(chǎn)物長度在80-150bp 之間，所以只需要變性和退火就可以了。SYBR@Green等染料法，最好在PCR擴增程序結(jié)束后，加一個溶解程序，來形成溶解曲線，判斷PCR產(chǎn)物的特異性擴增。而溶解程序，儀器都有默認(rèn)設(shè)置，或稍有不同，但都是一個在產(chǎn)物進行溶解時候，進行熒光信號的收集。

3. 儀器設(shè)置

所有儀器的操作都基本一致。設(shè)置的時候包括反應(yīng)板設(shè)置（plate setup）和程序設(shè)置（program setup）。我們以 ABI StepOne為例，詳細(xì)看一下反應(yīng)設(shè)置：

A. 首先是實驗?zāi)康倪x擇：定量還是其他。我們命名為“BioTeke”，進行“定量”實驗。

B. 實驗方法的選擇：我們選用的比較Ct的SYBR Green方法， Fast程序，以cDNA為模板進行。

C. 目的基因的設(shè)置：有幾個目的基因和目的基因的名稱。

D. 樣品的設(shè)置：包括哪個是實驗組，哪個是對照組。以及負(fù)對照的設(shè)置和生物重復(fù)的設(shè)置。

E. 對照組和內(nèi)參基因的設(shè)置：這個是為后面的定量做準(zhǔn)備

F. 反應(yīng)程序的設(shè)置：PCR反應(yīng)程序的設(shè)置要根據(jù)不同公司的MasterMix。比如BioTeke的95℃ 2分鐘就可以激活DNA聚合酶（ABI的需要10 分鐘）。循環(huán)反應(yīng)是95℃15秒，60℃15秒的40個循環(huán)。溶解曲線程序采用儀器默認(rèn)設(shè)置就可以。或者是儀器說明書上建議的程序。

G. 反應(yīng)體系的設(shè)置：

A-G這五個步驟簡單設(shè)置好，可以保存，修改反應(yīng)程序或者立刻進行反應(yīng)。需要注意一點ABI儀器需要加ROX參比染料，默認(rèn)的是ROX。有些公司是把ROX或者其他染料配制在MasteMix里面；也有的是單獨分開。要根據(jù)不同公司的MasterMix進行這一個步驟的選擇。BioTeke的MasterMix里沒有參比染料，所以選擇“none”。設(shè)置好之后，就可以把配置好的PCR管放進儀器，點擊RUN！

五、Real-time qPCR數(shù)據(jù)分析

1. Real-time qPCR常見參數(shù)

基線（baseline）

通常是3-15個循環(huán)的熒光信號

同一次反應(yīng)中針對不同的基因需單獨設(shè)置基線

閾值（threshold）

自動設(shè)置是3-15個循環(huán)的熒光信號的標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍

手動設(shè)置：置于指數(shù)擴增期，剛好可以清楚地看到熒光信號明顯增強

同一次反應(yīng)中針對不同的基因可單獨設(shè)置閾值，但對于同一個基因擴增一定要用同一個閾值。

Ct值:與起始濃度的對數(shù)成線性關(guān)系。

分析定量時候一般取Ct:15-35。太大或者太小都會導(dǎo)致定量的不準(zhǔn)確。

Rn（Normalized reporter）是熒光報告基團的熒光發(fā)射強度與參比染料的熒光發(fā)射強度的比值。
△Rn：△Rn是Rn扣除基線后得到的標(biāo)準(zhǔn)化結(jié)果（△Rn=Rn-基線）。

2. 影響Ct值的關(guān)鍵因素

模板濃度

模板濃度是決定Ct的最主要因素?？刂圃谝粋€合適范圍內(nèi)，使Ct在15-35之間

反應(yīng)液成分的影響

任何分子的熒光發(fā)射都受環(huán)境因素影響----比如溶液的pH值和鹽濃度。

PCR反應(yīng)的效率

PCR反應(yīng)的效率也會影響Ct值。在PCR擴增效率低的條件下進行連續(xù)梯度稀釋擴增，與PCR擴增效率高的條件下相比，可能會所產(chǎn)生斜率不同的標(biāo)準(zhǔn)曲線。PCR效率取決于實驗、反應(yīng)混合液性能和樣品質(zhì)量。一般說來，反應(yīng)效率在90-110%之間都是可以接受的。

3. 如何評估實時定量PCR反應(yīng)的效果

PCR擴增效率：為了正確地評估PCR擴增效率，至少需要做3次平行重復(fù)，至少做5個數(shù)量級倍數(shù)(5logs)連續(xù)梯度稀釋模板濃度。