原名：Metabolic landscape of the tumor microenvironment at single cell resolution

譯名：腫瘤微環(huán)境在單細(xì)胞分辨率下的代謝情況

期刊：Nature communications

影響因子：11.878

發(fā)表時間：2019年8月21日

通訊作者：肖正濤

通訊作者單位：美國杜克大學(xué)

DOI：10.1038/s41467-019-11738-0

腫瘤細(xì)胞代謝重編程以支撐細(xì)胞對能量、生物量、氧化還原維護(hù)以及細(xì)胞間交流的需求。細(xì)胞內(nèi)的代謝受基因和環(huán)境因素的影響，包括腫瘤進(jìn)化過程中驅(qū)動因子突變、起源組織以及局部的營養(yǎng)環(huán)境。然而圍繞腫瘤代謝的大多數(shù)結(jié)論是從細(xì)胞培養(yǎng)模型和模型器官獲得的，能夠直接觀察到的細(xì)胞代謝非常少。受環(huán)境因素的影響，在實驗室培養(yǎng)條件下腫瘤代謝相較于體內(nèi)環(huán)境表現(xiàn)出不同的特性，這些差異在人類模型器官的代謝中同樣存在。關(guān)于腫瘤代謝的結(jié)論也是每個細(xì)胞基因和環(huán)境的改變導(dǎo)致反映的整體均數(shù)。

腫瘤細(xì)胞存在于不同類型的非腫瘤細(xì)胞構(gòu)成的微環(huán)境中，包含腫瘤相關(guān)的成纖維細(xì)胞、免疫細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞或者其他基質(zhì)細(xì)胞的，這些細(xì)胞在促進(jìn)腫瘤生長中發(fā)揮重要作用，例如，癌癥相關(guān)的成纖維細(xì)胞釋放細(xì)胞因子和趨化因子在接收信號中發(fā)揮重要作用，腫瘤細(xì)胞中的免疫室控制免疫調(diào)節(jié)，內(nèi)皮細(xì)胞為脈管系統(tǒng)抵御微環(huán)境提供營養(yǎng)。不同的細(xì)胞都有不同的代謝需求來滿足特異的功能，此外每種細(xì)胞都經(jīng)歷不同的營養(yǎng)微環(huán)境、細(xì)胞外不同的信號、起源于不同的細(xì)胞從而有不同的突變圖譜。因此在細(xì)胞層面每個細(xì)胞都有不同的代謝狀態(tài)。在單細(xì)胞層面直接觀察體內(nèi)每個細(xì)胞的代謝狀態(tài)更是困難的。關(guān)于腫瘤微環(huán)境的研究結(jié)論大多都是通過體外模型例如共培養(yǎng)系統(tǒng)或者免疫組化染色測量單個代謝酶的表達(dá)。對腫瘤微環(huán)境內(nèi)單細(xì)胞水平的代謝狀況有待進(jìn)一步探討。

代謝及其相關(guān)的表型生物學(xué)受代謝物的濃度及其流速影響。在人體內(nèi)這些指標(biāo)的測量是困難的，且目前為止僅在實體瘤通過全基因組代謝基因表達(dá)間接測量。隨著單細(xì)胞測序技術(shù)的引入，檢測整個組織或者腫瘤中的單個細(xì)胞的代謝表達(dá)圖譜成為可能?；谀壳盎虮磉_(dá)提供的代謝通路活性的信息，且現(xiàn)有的報道基因表達(dá)能夠預(yù)測代謝的流速。利用單細(xì)胞測序技術(shù)有望提供更多人類腫瘤單細(xì)胞水平的代謝信息，從而更加全面的理解腫瘤代謝的異質(zhì)性。

在本文中研究者選取兩個代表性的腫瘤，惡性黑色素瘤和頭頸癌測量了超過9000個單細(xì)胞的代謝基因表達(dá)圖譜，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在癌細(xì)胞中代謝通路普遍更加活化，并且單個腫瘤細(xì)胞的代謝特征通過實體瘤中測量的方法很難測得。在癌細(xì)胞及非癌細(xì)胞中線粒體活性突變是代謝異質(zhì)性的主要原因且在單細(xì)胞層面糖酵解和氧化磷酸化與缺氧通路是一致的。研究者同時確定了不同的免疫細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞中的代謝特征，并且找到了與體外培養(yǎng)條件下不同的代謝行為。這些發(fā)現(xiàn)開始確立了在腫瘤微環(huán)境中惡性轉(zhuǎn)化是如何影響癌細(xì)胞和非癌細(xì)胞的代謝表型。

單細(xì)胞水平代謝基因表達(dá)圖譜

研究者開發(fā)了一種在單細(xì)胞水平分析代謝基因表達(dá)圖譜的計算機(jī)方法（圖1）。簡而言之是將缺失值填充和數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化方法運(yùn)用到基因表達(dá)圖譜來解釋技術(shù)噪音的影響。然后利用聚類分析定義單細(xì)胞水平代謝程序的整體結(jié)構(gòu)特征。利用開發(fā)的定量度量來確定細(xì)胞類型特異性的代謝程序，同時為定量腫瘤細(xì)胞或者非癌細(xì)胞的代謝異質(zhì)性設(shè)計算法。研究者利用人類黑色素瘤（包含4054個細(xì)胞）和頭頸癌（包含5502個細(xì)胞）單細(xì)胞RNA-seq的數(shù)據(jù)驗證了算法的可靠性。這一數(shù)據(jù)庫篩選是根據(jù)其含有最多的細(xì)胞數(shù)量和最詳細(xì)的細(xì)胞類型注釋，且包含不同基因型和表型的腫瘤細(xì)胞和非癌細(xì)胞，因此在每種類型細(xì)胞中能夠深入分析代謝基因的表達(dá)及其信號通路。

研究者首先利用t-SNE的方法對數(shù)據(jù)庫中包含的1566個代謝基因進(jìn)行了整體結(jié)構(gòu)的分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞中代謝基因的表達(dá)大多受病人特異的因素調(diào)控，這一現(xiàn)象同樣在腫瘤細(xì)胞代謝基因表達(dá)圖譜的高度相關(guān)性得到進(jìn)一步的驗證。在腫瘤細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了高度的相似性，然而在非癌細(xì)胞中沒有明顯的差異，這提示在腫瘤微環(huán)境中非癌細(xì)胞的代謝沒有表現(xiàn)出明顯的異質(zhì)性。t-SNE隨機(jī)試驗檢測基因表達(dá)的聚類分析提示，腫瘤細(xì)胞的代謝可塑性反應(yīng)了在基因表達(dá)上固有的靈活性影響了代謝的和非代謝的基因。

以上結(jié)果均提示腫瘤細(xì)胞表現(xiàn)出更高的代謝可塑性，且導(dǎo)致了相較于非癌細(xì)胞更易導(dǎo)致腫瘤微環(huán)境中細(xì)胞的特異性代謝重編程。

細(xì)胞特異性的代謝重編程

研究者進(jìn)一步探究了不同細(xì)胞中代謝通路突變體的整體特征。為了對代謝通路的活性進(jìn)行定量，研究者開發(fā)了代謝通路活性值（PAS）來定義這條通路在所有細(xì)胞中基因的相對表達(dá)水平（圖2）。同時為了進(jìn)一步比較不同細(xì)胞種屬之間的差異，研究者利用反卷積法對基因表達(dá)的值進(jìn)行調(diào)整結(jié)果發(fā)現(xiàn)四個常用數(shù)據(jù)庫中的表達(dá)值分布高度相似。在80條至少包含5個基因的信號通路中至少一種細(xì)胞類型中有超過70條的信號通路高度表達(dá)（PAS＞1，p＜0.01），這一結(jié)果提示大多數(shù)代謝通路的活性由細(xì)胞類型決定。例如不同細(xì)胞類型中氧化磷酸化和糖酵解的差異表達(dá)進(jìn)一步由不同類型細(xì)胞中這些通路基因的平均表達(dá)分布值驗證（p＜0.01）。KEGG信號通路分析將代謝通路劃分為11個類別，并且利用費(fèi)希爾精確檢驗評估了每個類別中上調(diào)信號通路的富集情況。這些類別反映了細(xì)胞代謝的不同情況，包括糖代謝、氨基酸代謝和核苷酸代謝。出乎意料的是，在某一特異的細(xì)胞類型中大多數(shù)類別并不在上調(diào)的信號通路中富集（黑色素瘤中11/11，頭頸癌中10/11；p＞0.05），提示在所有的類別中每種細(xì)胞類型都經(jīng)歷代謝通路整體的上調(diào)或者下調(diào)。在黑色素瘤和頭頸癌中腫瘤細(xì)胞擁有最大數(shù)量上調(diào)的代謝通路，黑色素瘤細(xì)胞有45條通路上調(diào)，癌相關(guān)成纖維細(xì)胞20條，巨噬細(xì)胞為22條，其他類型細(xì)胞都少于10條；頭頸癌細(xì)胞中有56條通路上調(diào)，成纖維細(xì)胞中28條，巨噬細(xì)胞中24條，B細(xì)胞為11條，其他細(xì)胞類型都少于10條。并且上調(diào)的信號通路包括細(xì)胞代謝的多個方面，例如中心碳代謝、一碳代謝、蛋氨酸代謝、類固醇生物合成、β-丙氨酸代謝。因此與非癌細(xì)胞相比，腫瘤細(xì)胞經(jīng)歷一個整體上調(diào)的代謝活性，且重要的是，僅在代謝相關(guān)的信號通路中的活性是上調(diào)的。有意思的是比較數(shù)據(jù)庫中黑色素瘤和頭頸癌代謝信號通路，結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩種癌癥中T細(xì)胞（Spearman’s correlation = 0.58, p-value = 3.6e-8）、腫瘤細(xì)胞（Spearman’s correlation = 0.45, p-value = 4.9e-5）、內(nèi)皮細(xì)胞（Spearman’s correlation = 0.43, p-value = 1.2e-4）和巨噬細(xì)胞（Spearman’s correlation = 0.44, p-value = 6.9e-5）高度一致，而在B細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的代謝通路（Spearman’s correlation < 0.1, p-value > 0.01 for both cell types）中幾乎不相關(guān)，這也提示這些細(xì)胞的代謝對環(huán)境的因素和免疫細(xì)胞的效應(yīng)狀態(tài)極為敏感。

研究者為了進(jìn)一步評估在單個腫瘤細(xì)胞中的信號通路活性是否與實體瘤組織樣本中的轉(zhuǎn)錄圖譜一致，利用實體瘤中的RNA-seq數(shù)據(jù)計算了代謝活性值并且與TCGA數(shù)據(jù)庫中的組織樣本比對，由于TCGA數(shù)據(jù)庫中不含黑色素瘤的正常組織，研究者比較了含43對正常的和腫瘤樣本的頭頸癌數(shù)據(jù)庫。為了比較TCGA中實體瘤基因表達(dá)值與單細(xì)胞RNA-seq數(shù)據(jù)，研究者重新構(gòu)建了腫瘤細(xì)胞中所有單細(xì)胞的基因表達(dá)圖譜，通過與實體瘤中的TCGA數(shù)據(jù)比較發(fā)現(xiàn)基因的表達(dá)水平與TCGA數(shù)據(jù)庫中的腫瘤樣本高度相關(guān)（average Pearson’s R = 0.77）。與非癌組織相比，腫瘤樣本中有6條信號通路上調(diào)34條信號通路下調(diào)（p-value < 0.01），且有24條信號通路的活性圖譜在實體瘤和單細(xì)胞中是一致的。顯著的是，25/56信號通路在單個腫瘤細(xì)胞中是上調(diào)的在非瘤細(xì)胞中是下調(diào)的。單細(xì)胞和RNA-seq的差異是細(xì)胞異質(zhì)性導(dǎo)致的。

以上結(jié)果均證實單細(xì)胞水平基因表達(dá)圖譜中代謝活性顯著富集。

腫瘤細(xì)胞代謝的異質(zhì)性

腫瘤細(xì)胞內(nèi)的代謝重編程受營養(yǎng)供應(yīng)、細(xì)胞間交流影響，探究腫瘤微環(huán)境的影響因素也非常有意義。研究者為了確定細(xì)胞內(nèi)代謝異質(zhì)性的主要原因，通過PCA和GSEA確定了代謝通路中富集的突變基因（圖3）。在選用的兩種腫瘤中，氧化磷酸化和三羧酸循環(huán)對代謝的異質(zhì)性發(fā)揮重要作用，這一結(jié)果提示線粒體活性的突變是腫瘤細(xì)胞代謝異質(zhì)性的主要原因。研究者進(jìn)一步探究了線粒體活性和氧氣、氧氣等環(huán)境因素之間的聯(lián)系。由于細(xì)胞內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)的狀態(tài)無法直接測量，研究者利用已知與缺氧通路相關(guān)基因的平均表達(dá)水平來衡量。利用氧化磷酸化相關(guān)基因的表達(dá)水平來替代線粒體的活性。同時糖代謝通路作為細(xì)胞生存和增殖能量和原材料的供應(yīng)通路同樣受到了研究者的關(guān)注，同時在癌癥代謝過程中糖代謝與氧化磷酸化的關(guān)系仍然是一個熱點(diǎn)。研究者發(fā)現(xiàn)在兩種腫瘤細(xì)胞中糖代謝和缺氧通路的特征高度相關(guān)（黑色素瘤中Pearson’s R = 0.72，頭頸癌中Pearson’s R = 0.52），這一結(jié)論與之前的報道缺氧能夠提高糖代謝的活性一致。重要的是研究者發(fā)現(xiàn)氧化磷酸化和糖代謝之間正先關(guān)，兩者在CCLE取的腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)中是缺少的。進(jìn)一步揭示有氧呼吸和缺氧信號通路這種出乎意料的聯(lián)系是腫瘤微環(huán)境中單個腫瘤細(xì)胞的獨(dú)特特征。此外兩種腫瘤細(xì)胞中氧化磷酸化、糖代謝以及缺氧的低表達(dá)水平與執(zhí)行期負(fù)調(diào)控的基因上調(diào)密切相關(guān)，這一亞群的細(xì)胞凋亡減少，有效促進(jìn)腫瘤的發(fā)展。

以上結(jié)果均證實線粒體的氧化磷酸化是腫瘤代謝異質(zhì)性的主要原因，氧化磷酸化為了適應(yīng)腫瘤微環(huán)境中氧供應(yīng)的變化不與提供能量的糖代謝相互排斥。

非癌細(xì)胞的代謝異質(zhì)性

在非癌細(xì)胞中代謝基因的表達(dá)圖譜依據(jù)細(xì)胞類型聚類，同時在不同腫瘤中的細(xì)胞沒有明顯的差異，研究者進(jìn)一步分析了非癌細(xì)胞中的代謝異質(zhì)性。通過PCA和GSEA以及氧化磷酸化突變體三羧酸循環(huán)發(fā)現(xiàn)，在非癌細(xì)胞中氧化磷酸化和三羧酸循環(huán)同樣是代謝異質(zhì)性的主要原因。這一結(jié)果提示在非癌細(xì)胞中線粒體的活性同樣是代謝異質(zhì)性的主要原因。

為了進(jìn)一步評估非癌細(xì)胞中線粒體的活性如何與氧氣供應(yīng)聯(lián)系，研究者在每種細(xì)胞類型中檢測了氧化磷酸化、糖代謝活性與缺氧相關(guān)的特征。在頭頸癌的數(shù)據(jù)庫中，除了巨噬細(xì)胞其他細(xì)胞均表現(xiàn)出糖代謝、氧化磷酸化、缺氧顯著相關(guān)。聯(lián)系癌細(xì)胞中的結(jié)論，研究者的發(fā)現(xiàn)挑戰(zhàn)了長久以來公認(rèn)的概念：中心碳代謝的代謝重編程在糖代謝和線粒體呼吸中扮演開關(guān)的角色。在單細(xì)胞水平，細(xì)胞面臨著更嚴(yán)重的氧氣消耗來上調(diào)糖代謝和線粒體的氧化磷酸化，幫助腫瘤細(xì)胞與其他細(xì)胞競爭有限的資源。在單細(xì)胞RNA-seq數(shù)據(jù)庫中的所有細(xì)胞中缺氧特征與能量生產(chǎn)的正相關(guān)高度保守（圖4）。

非癌細(xì)胞亞型的代謝特征

免疫細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞等非癌細(xì)胞是腫瘤微環(huán)境的重要組成部分，這些細(xì)胞分化成不同的亞型扮演不同的角色，而這一過程需要代謝重編程來滿足細(xì)胞對自主代謝的需求同時與其他細(xì)胞能夠相互作用。研究者利用scRNA-seq對T細(xì)胞和成纖維細(xì)胞亞型進(jìn)行代謝特征的分析，T細(xì)胞和成纖維細(xì)胞是黑色素瘤和頭頸癌數(shù)據(jù)庫中最大的非癌細(xì)胞群體。T細(xì)胞首先依據(jù)CD4和CD8A的表達(dá)分化成CD8+和CD4+，CD4+T細(xì)胞進(jìn)一步依據(jù)FOXP3和CD25的表達(dá)分化成調(diào)節(jié)型T細(xì)胞和輔助型T細(xì)胞。研究者通過GSEA分析確定每個亞型中代謝通路的富集，且發(fā)現(xiàn)氧化磷酸化是區(qū)分T細(xì)胞亞型最重要的信號通路：CD4+T細(xì)胞相較于CD8+T細(xì)胞氧化磷酸化的水平顯著更高。有趣的是，相較于輔助型T細(xì)胞，調(diào)節(jié)型T細(xì)胞有更高的糖代謝水平（圖5）。而這一結(jié)論與之前的報道輔助型T細(xì)胞的糖代謝水平更高相矛盾。另一方面氧化磷酸化傾向于CD4+T細(xì)胞和調(diào)節(jié)型T細(xì)胞與之前的報道是一致的。以上證據(jù)再次說明線粒體氧化代謝是T細(xì)胞亞型的普遍代謝特征，這些結(jié)果也提示腫瘤微環(huán)境中免疫細(xì)胞亞群的代謝特征有別于正常組織中的生物學(xué)行為。

研究者進(jìn)一步探究了成纖維細(xì)胞亞群中的代謝特征，成纖維細(xì)胞在正常組織中對傷口愈合等過程發(fā)揮重要作用，在癌組織中能夠通過細(xì)胞間交流促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長。依據(jù)之前的報道，在頭頸癌中1422個成纖維細(xì)胞被分成兩個亞群CAFs和肌纖維細(xì)胞。研究者通過GSEA分析比較了兩個成纖維細(xì)胞亞群的代謝基因表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)15條代謝信號通路上調(diào)從而區(qū)分開兩個細(xì)胞亞群。另一方面，肌醇磷脂代謝是肌纖維細(xì)胞中唯一上調(diào)的代謝通路，這也暗示CAFs的代謝活性更高。同時在CAFs中糖酵解顯著上調(diào)，糖酵解產(chǎn)生過量的乳酸被鄰近的腫瘤細(xì)胞利用來支撐生長。同時研究者發(fā)現(xiàn)了一些其他的代謝通路，包括花生四烯酸代謝、亞油酸代謝以及聚糖生物合成和降解。以上證據(jù)均證實CAFs的代謝表型能夠幫助他們與其他細(xì)胞相互作用并且調(diào)節(jié)腫瘤內(nèi)的微環(huán)境。

研究者通過利用腫瘤中單個細(xì)胞的基因表達(dá)譜，用以區(qū)分免疫細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞亞群的代謝特征，直接反映腫瘤及其微環(huán)境的代謝情況，包括許多已知和未知的細(xì)胞類型。對腫瘤微環(huán)境與單細(xì)胞測序技術(shù)聯(lián)合應(yīng)用開辟了新的前景。

隨著單細(xì)胞技術(shù)的應(yīng)用，結(jié)合腫瘤微環(huán)境的變化，目前相分離備受研究的矚目。在腫瘤微環(huán)境中小分子信號傳遞、細(xì)胞能量與物質(zhì)代謝、細(xì)胞的趨向性，任何一個過程的改變都會影響機(jī)體的正?；顒?。