雙硫死亡可謂是繼2022年初銅死亡發(fā)現(xiàn)以來又一細(xì)胞死亡領(lǐng)域的重大發(fā)現(xiàn)，下面我們就來看看該研究是如何開展的吧。

（原文鏈接：https://www./articles/s41556-023-01091-2）

整體思路

縱觀全文就會(huì)發(fā)現(xiàn)，本文的研究手法和銅死亡發(fā)現(xiàn)時(shí)的研究思路有異曲同工之妙（我的國自然標(biāo)書沒中，怎么改讓專家都說好？）。對(duì)比兩篇論文就能發(fā)現(xiàn)，兩者都是從已有程序性死亡方式入手，使用抑制劑進(jìn)行一一排除后，再基于數(shù)據(jù)庫或已有研究基礎(chǔ)找到新型死亡方式的誘導(dǎo)因素，從而命名。機(jī)制探索上，也都是通過組學(xué)手段進(jìn)行目標(biāo)關(guān)鍵分子/通路篩選，最后根據(jù)已有的信息整合推測(cè)可能機(jī)制，進(jìn)行常規(guī)的分子機(jī)制驗(yàn)證。

研究?jī)?nèi)容

第一步：排除其它程序性死亡和因素，明確死亡誘因并命名

如前所述，提出一種新型死亡方式的第一步是排除其它細(xì)胞死亡方式的干擾，以及找到真正影響并誘導(dǎo)該新型死亡產(chǎn)生的因素。由于之前研究發(fā)現(xiàn)在葡萄饑餓情況下，SLC7A11高表達(dá)細(xì)胞死亡死亡更迅速（這個(gè)分子是不是很眼熟？鐵死亡還記得嗎？），因此作者在葡萄糖充足和葡萄糖饑餓條件下，分別在細(xì)胞SLC7A11過表達(dá)細(xì)胞內(nèi)添加鐵死亡、凋亡、壞死性凋亡、自噬抑制劑，發(fā)現(xiàn)均無法阻止細(xì)胞死亡。然而，細(xì)胞死亡卻能夠被還原性試劑（TCEP）抑制。（圖1上）

圖1（上）

為了進(jìn)一步明確這一死亡是否受到其它死亡方式的干擾，作者特地在細(xì)胞中分別敲除鐵死亡另一關(guān)鍵通路蛋白ACSL4和凋亡關(guān)鍵誘導(dǎo)蛋白BAX/BAK，能夠抑制葡萄糖充足條件下的細(xì)胞死亡，卻依然無法逆轉(zhuǎn)葡萄糖饑餓條件下的死亡。

由于葡萄糖與能量代謝有關(guān)，因此作者還關(guān)注了ATP在該死亡方式中的作用。然而結(jié)果卻顯示，SLC7A11過表達(dá)細(xì)胞在葡萄糖饑餓條件下ATP水平顯著高于對(duì)照組，敲除SLC7A11能回復(fù)葡萄糖饑餓下二酰胺誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡。（圖1下）

總之，這些結(jié)果表明，這種新型死亡方式與二硫化物應(yīng)激有關(guān)，與ATP水平無關(guān)。因此將其命名為“雙硫死亡”。

圖1（下）

第二步：篩選下游關(guān)鍵通路

細(xì)胞內(nèi)的二硫化物應(yīng)激對(duì)氧化還原敏感的蛋白影響較大，因此接下來就是順理成章的組學(xué)篩選，尋找受到二硫化物應(yīng)激改變的通路。與普通蛋白組不同的是，文中使用的是二硫蛋白組學(xué)，即檢測(cè)二硫鍵變化的蛋白質(zhì)。從結(jié)果中可以看到，葡萄糖饑餓且SLC7A11高表達(dá)條件下，Actin-細(xì)胞骨架和細(xì)胞黏附相關(guān)通路顯著富集，包含大量actin細(xì)胞骨架蛋白如FLNA/B、MYH9、TLN1、ACTB等（圖2）。（所以后面實(shí)驗(yàn)的時(shí)候不能用actin作為內(nèi)參了）

圖2

第三步：深入的分子機(jī)制探索

1.雙硫死亡中細(xì)胞骨架蛋白的二硫鍵

蛋白質(zhì)形成二硫鍵后遷移速度會(huì)變慢，因此在非還原性WB中，如果蛋白形成二硫鍵，會(huì)在分子量較大位置出現(xiàn)條帶。利用這個(gè)原理，作者檢測(cè)了蛋白質(zhì)組篩選到的actin細(xì)胞骨架相關(guān)的蛋白FLNA/B、MYH9、TLN1、Drebrin、Actin等。結(jié)果顯示在葡萄糖饑餓條件下，非還原性膠中野生型細(xì)胞蛋白均產(chǎn)生二硫鍵，而敲除SLC7A11后能回復(fù)這一現(xiàn)象。能夠調(diào)節(jié)NADP /NADPH比的2DG同樣能夠回復(fù)該表型，但ROS清除劑（Tempo/Trolox）不能。之后，作者進(jìn)一步對(duì)遷移變緩的actin蛋白進(jìn)行質(zhì)譜分析，果然在這些蛋白質(zhì)上發(fā)現(xiàn)多個(gè)二硫鍵位點(diǎn)。

圖3

2.雙硫死亡中F-actin的收縮

既然之前的實(shí)驗(yàn)證明Actin細(xì)胞骨架相關(guān)的蛋白質(zhì)確實(shí)在葡萄糖饑餓，且SLC7A11高表達(dá)的情況下多個(gè)位點(diǎn)形成了二硫鍵，那么這些二硫鍵變化究竟導(dǎo)致了何種表型，從而最終走向了細(xì)胞死亡？為此，作者對(duì)F-Actin進(jìn)行了免疫熒光染色觀察，發(fā)現(xiàn)在葡萄糖饑餓條件下F-Actin調(diào)控的細(xì)胞骨架顯著收縮且與細(xì)胞膜分離；而敲除SLC7A11、同時(shí)進(jìn)行葡萄糖和胱氨酸饑餓處理、添加2DG均能回復(fù)收縮表型，但ROS清除劑無效，與之前的結(jié)果一致。該表型也與雙硫死亡時(shí)的細(xì)胞表型同步。（圖4）

圖4

3.Rac-WRC（WAVE調(diào)節(jié)復(fù)合物）調(diào)控雙硫死亡

為了深入探究葡萄糖饑餓和SLC7A11高表達(dá)引起F-Actin收縮的具體機(jī)制，作者對(duì)葡萄糖充足/饑餓條件下的SLC7A11過表達(dá)細(xì)胞進(jìn)行了CRISPR/Cas9篩選。結(jié)果顯示除了SLC7A11、SLC3A2之外，多個(gè)與線粒體氧化磷酸化及WAVE調(diào)節(jié)復(fù)合物相關(guān)的sgRNA富集。WAVE調(diào)節(jié)復(fù)合物（WRC）促進(jìn)actin多聚化和板狀偽足形成，與細(xì)胞骨架調(diào)控密切相關(guān)。而WRC中的關(guān)鍵蛋白NCKAP1、WAVE2的體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)其能夠調(diào)控雙硫死亡。Rac是WRC的上游激活因子，體外實(shí)驗(yàn)表明Rac1的活化形式促進(jìn)雙硫死亡。（圖5）

以上結(jié)果均證實(shí)，葡萄糖饑餓條件下，SLC7A11高表達(dá)細(xì)胞中Rac-WRC調(diào)控的骨架蛋白變化促進(jìn)雙硫死亡發(fā)生。

圖5

第四步：證明葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)和雙硫死亡的關(guān)系

既然雙硫死亡是在葡萄糖饑餓條件下發(fā)生，那么阻斷葡萄糖攝取是否與此等價(jià)？為此，作者使用葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（GLUT）抑制劑BAY和KL分別進(jìn)行處理，并檢測(cè)不同細(xì)胞程序性死亡抑制劑的效果，發(fā)現(xiàn)獲得的結(jié)果與葡萄糖饑餓條件下的相同。同樣，Actin相關(guān)蛋白的二硫鍵形成和F-actin收縮均與葡萄糖饑餓時(shí)相同。最后的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明，GLUT抑制劑能有效促進(jìn)雙硫死亡，抑制PDX腫瘤生長(zhǎng)，但僅限于SLC7A11高表達(dá)腫瘤細(xì)胞，對(duì)SLC7A11低表達(dá)腫瘤無效。

圖6

總結(jié)

本文的開始來源于觀察到的一個(gè)現(xiàn)象，即SLC7A11調(diào)控的胱氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)能夠抑制鐵死亡的發(fā)生，但卻不能阻止葡萄糖缺乏條件下的細(xì)胞死亡。為了研究這種特殊的死亡現(xiàn)象，作者利用不同死亡方式的抑制劑進(jìn)行葡萄糖充足/饑餓條件下的處理，將現(xiàn)象更加細(xì)化，即SLC7A11高表達(dá)細(xì)胞在葡萄糖饑餓條件下，才會(huì)經(jīng)歷不同于目前已知細(xì)胞死亡方式的死亡過程。

在定義和證明這種新型死亡的過程中，作者聯(lián)系并推測(cè)以胱氨酸為代表的二硫鍵的作用，以及通過蛋白質(zhì)組學(xué)和CRISPR篩選最終鎖定了其中的分子機(jī)制。這一過程少不了對(duì)目標(biāo)分子功能和細(xì)胞內(nèi)代謝途徑的深入理解，以及對(duì)大數(shù)據(jù)結(jié)果的篩選經(jīng)驗(yàn)。

“雙硫死亡”究竟是否會(huì)成為下一個(gè)研究熱點(diǎn)和腫瘤治療潛在靶點(diǎn)呢？讓我們拭目以待！

雙硫死亡分子機(jī)制示意圖