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前言 2020年12月FDA緊急批準(zhǔn)了兩款針對新冠病毒SARS-CoV-2的mRNA疫苗，分別是BioNTech/Pfizer的BNT162b2（COMIRNATY?）和Moderna的mRNA-1273（SPIKEVAX?）。隨著這兩款mRNA疫苗的上市，以mRNA作為預(yù)防和治療手段的管線越來越多，研究逐漸趨于白熱化。 mRNA疫苗的原理是將病毒的mRNA在體外修飾后遞送至機(jī)體細(xì)胞內(nèi)，表達(dá)產(chǎn)生的抗原蛋白可以刺激機(jī)體產(chǎn)生針對該抗原的免疫應(yīng)答，擴(kuò)大機(jī)體的免疫能力。相比傳統(tǒng)疫苗，mRNA疫苗生產(chǎn)工藝簡單、開發(fā)速度快、無需細(xì)胞培養(yǎng)，整體研發(fā)成本較低，體現(xiàn)出非常明顯的優(yōu)勢。與DNA疫苗相比mRNA疫苗也具有更高的安全性，因?yàn)閙RNA在細(xì)胞質(zhì)核糖體中被整合表達(dá)，無需進(jìn)入細(xì)胞核，沒有整合至宿主基因組導(dǎo)致基因突變的風(fēng)險(xiǎn)。然而，mRNA疫苗加速研發(fā)的過程中也伴隨著越來越多的疑問，比如對于mRNA疫苗，是否需要在臨床前研究其藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì)，如何研究，結(jié)果又是怎樣的。本文將通過對已上市兩款疫苗臨床前數(shù)據(jù)的解讀，為mRNA疫苗的研發(fā)提供參考。 BNT162b2和mRNA-1273的臨床前藥代動(dòng)力學(xué)研究均可以歸納為兩個(gè)部分：一是針對mRNA進(jìn)行的生物分布研究；二是針對新型脂質(zhì)成分進(jìn)行的動(dòng)物體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)、組織分布、排泄和代謝研究。這兩個(gè)部分分別對應(yīng)了mRNA疫苗本身以及疫苗使用的LNP遞送系統(tǒng)。對mRNA進(jìn)行的研究主要是基于FDA疫苗開發(fā)和許可指導(dǎo)原則中明確提出當(dāng)疫苗包含新穎結(jié)構(gòu)且現(xiàn)有平臺技術(shù)沒有可支持的生物分布數(shù)據(jù)時(shí)需考慮在動(dòng)物上進(jìn)行體內(nèi)生物分布研究[1]。而對于LNP遞送系統(tǒng)，可以參考《新型冠狀病毒預(yù)防用mRNA疫苗藥學(xué)研究技術(shù)指導(dǎo)原則》中提到的，對于全球均未用過的遞送物質(zhì)，應(yīng)參照《新藥用輔料非臨床安全性評價(jià)指導(dǎo)原則》進(jìn)行詳細(xì)的研究，即按照臨床相關(guān)的給藥途徑，以與非臨床安全性評價(jià)中相同的動(dòng)物種屬來研究輔料的吸收、分布、代謝和排泄[2,3]。  表1. BNT162b2的臨床前藥代動(dòng)力學(xué)研究總結(jié)  1 BNT162b2 mRNA生物分布研究[4] BNT162b2 mRNA的生物分布采用活體成像法進(jìn)行研究。小鼠的兩條后肢分別肌肉注射LNP包裹熒光素酶（Luciferase）modRNA，給藥6小時(shí)后注射部位和肝臟中均檢測到熒光。肝臟中熒光表達(dá)量相對較低且給藥后48小時(shí)無法檢測到熒光，而注射部位的熒光持續(xù)時(shí)間更長，小鼠全身總熒光量于給藥后第9天降低至基線水平。由于熒光成像法靈敏度和精細(xì)程度的限制，無法準(zhǔn)確量化每個(gè)組織或部位的熒光分布，即RNA的分布。  圖1. BNT162b2 mRNA小鼠體內(nèi)分布 （左圖為小鼠全身活體成像圖，圈出部位為小鼠兩條后肢上的給藥部位；右圖為小鼠總熒光定量結(jié)果） 2 ALC-0315和ALC-0159的大鼠體內(nèi) 藥代動(dòng)力學(xué)研究[4] ALC-0315和ALC-0159是BNT162b2 的LNP遞送系統(tǒng)中使用的兩種新型脂質(zhì)分子。ALC-0315是一種陽離子脂質(zhì)，可以調(diào)控mRNA進(jìn)入細(xì)胞后的內(nèi)含體逃逸過程。ALC-0159是一種PEG修飾脂質(zhì)，能夠在空間上形成一個(gè)包裹mRNA的親水層，有利于RNA的穩(wěn)定儲存、減少與蛋白的特異性吸附。 同樣采用LNP包裹熒光素酶modRNA對兩個(gè)脂質(zhì)分子的大鼠體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)進(jìn)行研究，modRNA劑量1mg/kg時(shí)相當(dāng)于大鼠分別給藥15.3mg/kg的ALC-0315和1.96 mg/kg的ALC-0159。靜脈注射后，ALC-0315和ALC-0159從血中快速分布到肝臟，血中藥時(shí)曲線相似，肝臟中ALC-0315的暴露遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于ALC-0159，呈現(xiàn)長時(shí)間的肝臟分布。與給藥劑量相比，ALC-0315的肝臟分布約占60%，ALC-0159的肝臟分布僅為20%。給藥2周后，ALC-0315和ALC-0159的血藥濃度分別下降約7000倍和8000倍，而肝臟中ALC-0315和ALC-0159的濃度則分別下降約4倍和250倍以上。ALC-0159在血液和肝臟中的末端消除半衰期約2~3天，ALC-0315為6~8天。 此試驗(yàn)中同時(shí)對兩個(gè)脂質(zhì)的尿糞排泄進(jìn)行了研究。尿液中未檢測到ALC-0315和ALC-0159，糞便中ALC-0315和ALC-0159的排泄率分別為1%和50%。兩種脂質(zhì)成分的排泄回收率均不足，說明其在體內(nèi)存在一定程度的代謝清除。  圖2. ALC-0315和ALC-0159在大鼠血漿（左）  3 BNT162b2 LNP體內(nèi)分布研究[4] BNT162b2 LNP的體內(nèi)分布通過同位素試驗(yàn)進(jìn)行表征。實(shí)驗(yàn)中使用的LNP添加了痕量的放射性[3H]-CHE，該脂質(zhì)標(biāo)記物不會和細(xì)胞脂質(zhì)發(fā)生交換，也不會被代謝，常用于脂質(zhì)的代謝和攝取等研究。雌雄大鼠肌肉注射包裹了熒光素酶modRNA的這種LNP后，注射部位的放射性水平始終最高。除給藥部位以外，在血漿和大部分組織中也檢測到一定的放射性，且給藥后1~4小時(shí)內(nèi)血漿分布高于組織分布。給藥后48小時(shí)內(nèi)，LNP主要分布在肝臟、腎上腺、脾臟和卵巢，Tmax在給藥后8~48小時(shí)范圍內(nèi)。LNP在大鼠體內(nèi)的分布沒有明顯的雌雄差異，除給藥部位以外，LNP在大鼠體內(nèi)不同組織的雌雄總回收率（%給藥劑量）由高到低依次是：肝臟（18%）>> 脾臟（≤1.0%）> 腎上腺（≤0.11%）≈ 卵巢（≤0.095%），提示該遞送系統(tǒng)有明顯的肝靶向性。 4 ALC-0315和ALC-0159的體內(nèi)外代謝 研究[4] ALC-0315在體內(nèi)和體外孵育系統(tǒng)中均檢測到了酯鍵水解后的四種代謝產(chǎn)物，在體內(nèi)水解產(chǎn)物會進(jìn)一步與葡萄糖醛酸結(jié)合，綜合體內(nèi)外代謝產(chǎn)物判斷ALC-0315主要的代謝途徑是水解和葡萄糖醛酸結(jié)合。ALC-0159主要的代謝途徑為酰胺鍵水解生成N,N-ditetradecylamine。兩個(gè)脂質(zhì)的水解代謝在四個(gè)種屬（人、大鼠、小鼠、猴子）的基質(zhì)中均存在。ALC-0315和ALC-0159的生物轉(zhuǎn)化途徑如圖3和圖4所示。  圖3. ALC-0315可能的生物轉(zhuǎn)化途徑  圖4. ALC-0159可能的生物轉(zhuǎn)化途徑  01 mRNA-1273 mRNA的生物分布[5] Moderna在申報(bào)mRNA-1273疫苗上市時(shí)使用了mRNA-1647的相關(guān)生物分布數(shù)據(jù)，而沒有直接對mRNA-1273進(jìn)行研究。兩者的差別包括兩個(gè)方面，首先mRNA-1273包含一條編碼全長SARS-CoV-2 S-2P蛋白的mRNA，mRNA-1647包含6條mRNA，分別編碼全長CMVgB和gH/gL/UL128/UL130/UL131A 五聚體糖蛋白；另外，兩個(gè)疫苗使用的LNP遞送系統(tǒng)具有相同的脂質(zhì)成分，但mRNA-1273的脂質(zhì)納米顆粒略小于mRNA-1647。目前還無法確定納米顆粒的大小是否會顯著影響mRNA的組織分布，但Moderna認(rèn)為兩個(gè)納米顆粒的直徑均小于大鼠肝竇內(nèi)皮細(xì)胞上的孔徑（161nm），推測納米顆粒大小的差別對于LNP遞送的肝臟分布影響較小。 mRNA-1647的組織分布在雄性SD大鼠上開展。大鼠經(jīng)肌肉注射100μg 的mRNA-1647，給藥2小時(shí)后大部分組織都檢測到了mRNA，包括腦、心臟、肺、眼球和睪丸。組織達(dá)峰時(shí)間在給藥后2~24小時(shí)，且組織暴露量均高于血漿暴露量。與BNT162b2類似，mRNA-1647顯著的肝臟分布證實(shí)了LNP遞送系統(tǒng)的肝靶向特征。另外，mRNA-1647在給藥部位、淋巴結(jié)、脾臟和眼部的濃度也均超過血漿濃度。 mRNA-1647在血漿中快速消除，半衰期僅2.7~3.8小時(shí)，但在組織中消除速率明顯降低。給藥部位、腘窩近端淋巴結(jié)、腋窩遠(yuǎn)端淋巴結(jié)以及脾臟中6個(gè)mRNA的平均半衰期分別為14.9、34.8、31.1和63.0小時(shí)，其他組織在給藥3天后mRNA含量低于最低檢測限，腦組織中mRNA 的Tlast約為給藥后25小時(shí)。 除了以上mRNA-1647的大鼠組織分布數(shù)據(jù)，在針對mRNA-1273開展的毒理試驗(yàn)中也同時(shí)對組織中的mRNA濃度進(jìn)行了檢測。除腎臟外，其他組織中均檢測到了低濃度的mRNA，包括肝臟、心臟、肺臟、睪丸和腦，其中腦組織中mRNA濃度約為血中濃度的2%~4%，說明LNP遞送的mRNA可以在一定程度上穿過血腦屏障分布到腦中。 02 mRNA-1273 脂質(zhì)分子的PK、 分布、代謝和排泄[5] mRNA-1273的LNP系統(tǒng)中包含兩個(gè)新型脂質(zhì)分子SM-102和PEG2000-DMG，結(jié)構(gòu)如圖5所示。  圖5. SM-102和PEG2000-DMG的分子結(jié)構(gòu) Moderna沒有專門對SM-102的分布、代謝和藥動(dòng)學(xué)進(jìn)行研究，但在申報(bào)資料中結(jié)合其結(jié)構(gòu)類似物SM-86的數(shù)據(jù)對該類結(jié)構(gòu)的體內(nèi)分布、代謝和排泄特征進(jìn)行了討論。生物分布方面，SM-86的體內(nèi)分布和對應(yīng)LNP遞送的mRNA是一致的。SM-86在體內(nèi)可經(jīng)酯鍵水解被快速代謝，產(chǎn)生的脂肪酸代謝物可以通過膽汁和腎臟快速排泄。另外，定量全身放射自顯影(QWBA)結(jié)果顯示SM-86及其代謝物在所有組織中的暴露均不超過168小時(shí)。綜合這些結(jié)果認(rèn)為重復(fù)給藥后SM-102不會在體內(nèi)大量蓄積，由此預(yù)測陽離子脂質(zhì)SM-102產(chǎn)生毒性的可能性較小。  ▲ mRNA的生物分布特征取決于所使用的LNP遞送系統(tǒng)，參考上市疫苗的申報(bào)資料， FDA可以接受使用相同LNP包裹替代RNA開展mRNA疫苗組織分布研究。 ▲ 肌肉注射mRNA疫苗后，mRNA血液暴露量低于組織暴露量，在注射部位會有一個(gè)長時(shí)間的持續(xù)分布，而LNP本身的肝靶向性則決定了mRNA在肝臟中有較高的暴露。此外，淋巴結(jié)和脾臟作為免疫器官也具有一定的分布，需要在研究中重點(diǎn)關(guān)注。整體而言，mRNA在絕大多數(shù)組織中分布和消除均很迅速，基本上給藥后24小時(shí)之前可以達(dá)峰，給藥后72小時(shí)內(nèi)消除完全。但需注意mRNA在注射部位、淋巴結(jié)和脾臟中可能持續(xù)分布2~3周的時(shí)間，消除速率較慢。 ▲ LNP遞送系統(tǒng)的組成成分中，磷脂和膽固醇屬于體內(nèi)天然存在的內(nèi)源性脂質(zhì)，不需要評估其藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì)。而陽離子脂質(zhì)和PEG脂質(zhì)作為外源性的成分，考慮到進(jìn)入體內(nèi)后機(jī)體對其處置過程，以及它們可能產(chǎn)生的毒性和免疫原性是未知的，需要評估其吸收、分布、代謝和排泄的過程。 結(jié)語 本文通過對BNT162b2和mRNA-1273臨床前藥代動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)進(jìn)行解讀，在有限的數(shù)據(jù)基礎(chǔ)上對LNP遞送mRNA疫苗的藥代動(dòng)力學(xué)特征進(jìn)行了總結(jié)，為mRNA疫苗的臨床前研發(fā)提供了一些思路和依據(jù)。此外，藥明康德DMPK部門建立了一體化生物分析平臺，包含針對mRNA血漿和組織檢測的qPCR，bDNA方法及針對遞送載體的質(zhì)譜檢測方法等，結(jié)合我們豐富的藥代動(dòng)力學(xué)研發(fā)經(jīng)驗(yàn)，期待助力客戶快速推進(jìn)mRNA疫苗和藥物的項(xiàng)目進(jìn)程。 參考文獻(xiàn)： [1] Development and Licensure of Vaccines to Prevent COVID-19 (https://www./regulatory-information/search-fda-guidance-documents/development-and-licensure-vaccines-prevent-covid-19） [2]新型冠狀病毒預(yù)防用mRNA疫苗藥學(xué)研究技術(shù)指導(dǎo)原則 (https://www./zdyz/opinioninfopage?zdyzIdCODE=9efa70b504dc5c66965001181a49c30b&rddt=1) [3]新藥用輔料非臨床安全性評價(jià)指導(dǎo)原則 (https://www./zdyz/domesticinfopage?zdyzIdCODE=9320dbe8ae0bdb1f798ad9971bcd0dc1) [4] Public Assessment Report Authorisation for Temporary Supply COVID-19 mRNA vaccine BNT162 (https://www./vaccines-blood-biologics/comirnaty) [5] EMA Public Assessment-Report of COVID-19 Vaccine Moderna (https://www.ema./en/documents/assessment-report/comirnaty-epar-public-assessment-report_en.pdf) 作者：劉歡，馬利萍，金晶 編輯：方健，錢卉娟 設(shè)計(jì)：倪德偉，張瑩瑩  |
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