慢性子宮內(nèi)膜炎的發(fā)病率在不同人群中不盡相同：

• 一般人群中的慢性子宮內(nèi)膜炎患病率不明確，約0.8%~27.1% 

• 慢性子宮內(nèi)膜炎在不孕患者中的患病率為 2.8%~30% 

• 而在不明原因復發(fā)性流產(chǎn)或反復著床失敗的患者中高達67.5%。

其病理改變與內(nèi)膜中微生物群的定性、定量改變有關。

近年來，人類微生物組學的研究表明，人體不同系統(tǒng)內(nèi)微生物群與人類健康和疾病發(fā)病機制存在密切關系，刺激炎癥并增加癌癥等疾病發(fā)生的風險。作為人體主要的微生物組，陰道菌群對于女性生理和生殖健康起著重要作用。

◆陰道病原體感染是慢性子宮內(nèi)膜炎的病因之一

Moreno等人通過微生物培養(yǎng)在慢性子宮內(nèi)膜炎女性子宮內(nèi)膜中發(fā)現(xiàn)了包括無乳鏈球菌和淋病奈瑟菌在內(nèi)的細菌，并開發(fā)了一種診斷慢性子宮內(nèi)膜炎的分子方法——逆轉錄聚合酶鏈反應試驗，從這些病原體中識別DNA，用于慢性子宮內(nèi)膜炎的診斷。

◆慢性子宮內(nèi)膜炎：宮腔內(nèi)致病菌增加

隨著微生物組學技術的發(fā)展，傳統(tǒng)觀點認為宮腔內(nèi)是無菌環(huán)境的觀念也逐漸被推翻。16S和宏基因組測序等技術均證實宮腔內(nèi)存在微生物的定植，健康女性以乳桿菌屬占絕對優(yōu)勢，且宮腔內(nèi)微生物與慢性子宮內(nèi)膜炎的發(fā)病存在關聯(lián)，慢性子宮內(nèi)膜炎患者宮腔非乳酸桿菌為優(yōu)勢菌群且致病菌如加德納菌、葡萄球菌、鏈球菌檢出率增加。

在研究中也指出，診斷患有慢性子宮內(nèi)膜炎的女性陰道微生物群生態(tài)失調(diào)。與子宮內(nèi)膜沖洗樣品相比，陰道分泌物可以作為診斷慢性子宮內(nèi)膜炎的更無創(chuàng)和更經(jīng)濟有效的生物標志物。陰道宮頸黏液的免疫學指標已被認為是子宮內(nèi)膜炎的潛在診斷生物標志物。然而，需要進一步評估陰道微生物組在慢性子宮內(nèi)膜炎中的診斷潛力。

慢性子宮內(nèi)膜炎患者的選擇標準如下:

• 1) 年齡在20~40歲之間;

• 2) 診斷為不孕癥，定義為35歲以下婦女至少12個月未能懷孕，35歲及以上婦女至少6個月未能懷孕;

• 3) 陰道分泌物正常，通過手術前Nugent評分0至3分證實;

• 4) 根據(jù)促黃體生成素激增后7天子宮內(nèi)膜活檢的組織病理學結果，在隨機選擇的30個高倍視野中至少一個視野中有5個以上的MUM- 1+/CD138+細胞，診斷為CE。

排除標準為:

• 1) 在1周內(nèi)使用抗生素和/或益生菌制劑(局部或全身);

• 2) 采集樣本前1周內(nèi)有性行為;

• 3) 取樣前1個月內(nèi)陰道沖洗;

• 4) 最近6個月內(nèi)使用過宮內(nèi)節(jié)育器;

• 5) 吸煙和/或飲酒。除診斷為CE外，非CE組具有相同的納入和排除標準。

注：所有受試者均獲得書面同意，并經(jīng)武漢大學人民醫(yī)院倫理委員會批準(批準通知號:WDRY2023- K090)。

該研究的設計和流程圖如圖所示：

在本研究中，所有樣本均在子宮內(nèi)膜活檢前采集。用無菌生理鹽水擦拭外陰。隨后，使用無潤滑劑的一次性無菌陰道窺鏡完全暴露宮頸。使用兩個無菌拭子從后穹窿收集陰道分泌物：一個使用Nugent評分法進行評估，另一個儲存在?80°C下用于后續(xù)16S rRNA基因測序分析。

項目采用杭州谷禾核酸提取試劑盒(GHFDE100)提取陰道沖洗液樣本的基因組DNA。用引物515F(5'- GTGCCAGCMGCCGCGGTAA- 3')和806R(5'- GGACTACHVGGGTWTCTAAT- 3')擴增16S rRNA的V4區(qū)。為了實現(xiàn)多重測序，將樣品特異性對端6bp條形碼集成到TrueSeq適配器中。純化和定量后，整個DNA池在Illumina NovaSeq6000平臺(Illumina)上按照協(xié)議進行測序。

使用Vsearch v2.22.1組裝拼接雙端序列，并以100%的相似性閾值將序列聚類為相同的擴增子序列變體(amplicon sequence variant, ASV)。利用QIIME2加權分類器獲得ASV的分類信息。基于R包“VennDiagram”生成維恩圖來說明分組間共有的和獨有的ASV。

α-多樣性是指群落內(nèi)的物種多樣性，以物種豐富度和歸一化香農(nóng)熵(均勻度)為其顯著組成部分。物種豐富度采用Chao1指數(shù)進行量化，而Shannon多樣性指數(shù)同時評估豐富度和均勻度。通過主坐標分析（PCoA）可視化兩個組之間樣本的微生物菌落結構。使用R的vegan包進行相似性分析（ANOSIM）評估微生物群落的差異。

此外，為了預測微生物的代謝功能，使用京都基因與基因組百科全書（KEGG）數(shù)據(jù)庫與PICRUSt2 (Phylogenetic Investigation of Communities by Reconstruction of Unobserved States)進行代謝途徑富集分析。組間的統(tǒng)計差異使用Kruskal-Wallis檢驗和Wilcoxon秩和檢驗進行評估，顯著性水平定義為P < 0.05。

為了評估陰道微生物群組成對慢性子宮內(nèi)膜炎(CE)的診斷潛力，應用隨機森林算法，這是一種穩(wěn)健的監(jiān)督學習算法。使用R的pROC軟件包生成的受試者工作特征(ROC)曲線評估模型的整體性能。曲線下的面積（AUC）量化了ROC曲線的判別能力。此外，還計算模型的特異性、敏感性和準確性。

連續(xù)變量的臨床特征差異使用Student's t檢驗進行評估，而分類變量則需要使用χ2檢驗或Fisher精確檢驗進行評估。統(tǒng)計分析使用SPSS版本27（IBM）進行，P < 0.05被認為具有統(tǒng)計學意義。

在98名參與者中，49名被診斷為CE，其標準是在30個隨機選擇的高倍視野中至少有一個視野中觀察到超過5個MUM-1+/CD138+細胞?；€特征包括年齡、體重指數(shù)、抗穆勒激素水平和流產(chǎn)史，在兩組之間顯示了可比性(見表1)。

等級豐度曲線描述了兩組微生物群落的物種豐富度和均勻度。曲線范圍越寬表明物種豐度越高，曲線越光滑表明物種分布越均勻。

從曲線上看，CE組的物種豐富度和均勻度高于非CE組(圖2a)。維恩圖顯示，兩組共有1180個ASV中的664個，其中CE組特有的ASV為354個(圖2b)。利用Chao1豐富度估計器和Shannon多樣性指數(shù)量化的α-多樣性結果顯示，兩組間差異不顯著(Chao1的P = 0.1733, Shannon的P = 0.9043，圖2c,d)。

為了說明樣品之間的微生物組分布空間，進行了PCoA，如圖2e所示。結果顯示，兩組樣本的分布是對稱的。

值得注意的是，ANOSIM結果顯示組間差異大于組內(nèi)差異，盡管沒有達到統(tǒng)計學意義(R = 0.022, P = 0.085)(圖2f)。

陰道微生物群的細菌多樣性

(a)用秩豐度曲線評價細菌的相對均勻度;

(b)顯示組間重疊的維恩圖;

(c)采用Chao1指數(shù)；

(d)Simpson指數(shù)估算口腔微生物多樣性；

(e)使用Bray-Curtis通過主坐標分析計算β多樣性；

(f)通過相似性分析計算了組間微生物群落的差異。

慢性子宮內(nèi)膜炎患者陰道微生物群落的系統(tǒng)發(fā)育概況

門(a)、科(b)、屬(c)水平上細菌群落的平均組成。CE組與非CE組間差異有統(tǒng)計學意義(均 P?<?0.05)。0.01 <矯正 P?≤?0.05 ，標記為*。

通過KEGG途徑富集的功能分析揭示了CE組中幾種上調(diào)的途徑，如圖4所示。具體而言，參與多糖生物合成和代謝的途徑（包括鞘糖脂生物合成、糖胺聚糖降解和其他多糖降解過程）上調(diào)。

此外，萜類和聚酮類代謝、II型聚酮類生物合成、鞘脂質(zhì)代謝、次生代謝物生物合成、鏈霉素生物合成、外源生物降解、氯烷烴和氯烯烴降解以及凋亡相關途徑也上調(diào)?？偣灿?個KEGG模塊在CE組顯著富集，重點是代謝相關途徑(均P?<?0.05)。

KEGG代謝通路的豐度差異

0.01<?校正P≤0.05，標記為*;0.001?<校正P≤0.01，標記為**。CE，慢性子宮內(nèi)膜炎。

為測試陰道微生物組對慢性子宮內(nèi)膜炎(CE)的診斷潛力，這里構建了一個隨機森林分類器模型，用以區(qū)分CE樣本和非CE樣本。訓練集用于模型訓練，測試集用于評估模型性能。通過在發(fā)現(xiàn)階段重復五次的10倍交叉驗證，我們識別出四個最優(yōu)標記 ASV 作為CE的標記集（圖5a）。

這些選定ASV的對應細菌屬包括：

• 腸桿菌屬(Enterobacter)（ASV_49）

• 普氏菌屬(Prevotella)（ASV_169）

• 糞桿菌屬(Faecalibacterium)（ASV_265）

• 考拉桿菌屬(Phascolarctobacterium)（ASV_90）

隨機森林模型在訓練集隊列上的AUC值為85.68%(95%置信區(qū)間[CI]， 75.62%-95.73%)，在測試集隊列上的AUC值為83.26% (95% CI, 68.67%-97.85%)(圖5b)。模型的特異性為82.76%，靈敏度為79.49%，準確率為80.88%。

這些發(fā)現(xiàn)表明，基于陰道微生物ASV標記的隨機森林模型在區(qū)分CE和非CE隊列方面表現(xiàn)出強大的診斷潛力。

圖5.通過隨機森林模型鑒定用于臨床診斷的微生物標志物。

(a)使用陰道樣品中四種選定生物標志物的概況，來自隨機森林模型的變量的平均降低準確度。

(b)接收器工作特征曲線基于組織樣本的訓練集和測試集。ASV，擴增子序列變體; AUC，曲線下面積。

◆陰道菌群的變化可引起宮腔的菌群失調(diào)

陰道和宮腔內(nèi)的菌群變化有一定的同步性，陰道菌群的變化可引起宮腔內(nèi)的菌群失調(diào)，從而影響女性生殖健康。

本研究旨在對有或沒有慢性子宮內(nèi)膜炎(CE)的女性陰道微生物組的群落結構和功能進行初步探索。此外，文章中還提出了基于陰道微生物ASV的新型非侵入性CE診斷標志物。

◆特定的菌群可作為新型非侵入性CE診斷標志物

與先前的研究結果一致，該研究中沒有發(fā)現(xiàn)慢性子宮內(nèi)膜炎組和非慢性子宮內(nèi)膜炎組陰道微生物組之間的α-多樣性或β-多樣性有顯著差異。

值得注意的是，微生物組的低組內(nèi)變異情況表明其作為潛在診斷標記具有一定的穩(wěn)健性。與非CE組相比，慢性子宮內(nèi)膜炎組中幾個低豐度屬的富集程度不同，包括雙歧桿菌，普雷沃氏菌和加德納菌。

雙歧桿菌

雙歧桿菌以其保護作用而聞名，其高豐度在CE組中令人驚訝。雙歧桿菌菌株作為益生菌用于腸道炎癥、嚴重疾病和抑郁癥患者的腸道微生物組調(diào)節(jié)已有很長的歷史。然而，其他研究報告稱，在一些不健康的情況下，包括子宮內(nèi)膜異位癥、高危人乳頭瘤病毒和不孕癥，陰道中雙歧桿菌含量很高。這種不一致的潛在機制尚不清楚，需要進一步研究。

加德納菌和普氏菌

加德納菌和普氏菌是公認的陰道生態(tài)失調(diào)的指標。這些屬的定植改變了免疫系統(tǒng)，并誘導了促炎反應。在宿主-微生物共培養(yǎng)模型中，加德納菌與宮頸陰道屏障的破壞有關，同時促進小鼠中普雷沃菌屬對上生殖道的侵入性感染。

總的來說，該研究結果表明，兩組之間的陰道微生物組發(fā)生了實質(zhì)性變化，突顯了陰道沖洗液樣本作為檢測慢性子宮內(nèi)膜炎的診斷工具的潛力。

◆陰道菌群的變化可引起宮腔的菌群失調(diào)

KEGG途徑富集分析強調(diào)了關鍵代謝過程的上調(diào)，特別是CE組的聚糖生物合成和代謝。覆蓋陰道上皮細胞的聚糖涂層是保護屏障的重要組成部分。乳桿菌與陰道上皮的粘附被認為是具有競爭性地抑制病原體，而上皮的糖胺聚糖在這些過程中起著至關重要的作用。

值得注意的是，糖胺聚糖的消耗與宮頸上皮細胞屏障功能的破壞有關，這可能會增加對局部細菌和上升感染的易感性。這表明CE患者的微生物組失調(diào)可能會對微生物侵入陰道的主要門戶產(chǎn)生負面影響，并引發(fā)宮內(nèi)炎癥。

關于慢性子宮內(nèi)膜炎(CE)的標準化定義和診斷指南仍存在爭議，最被接受的診斷依賴于子宮內(nèi)膜活檢。基于選定的陰道微生物群構建了CE診斷模型。本文研究中，引入了一種新的隨機森林模型，該模型可以根據(jù)ASV以更高的靈敏度和準確性將CE患者與使用陰道分泌物的健康個體區(qū)分開來。該研究結果表明，陰道微生物組的變化可以作為診斷CE的指標，為慢性子宮內(nèi)膜炎提供了一種更容易獲得和更方便患者的診斷選擇。

然而，該研究也存在一定的局限性。首先，它主要側重于檢查有慢性子宮內(nèi)膜炎和沒有慢性子宮內(nèi)膜炎的女性之間的成分差異，而不是研究與慢性炎癥相關的免疫失調(diào)的潛在機制。其次，陰道微生物樣本是在分泌中期收集的，這可能無法解釋整個月經(jīng)周期中微生物群組成的變化。第三，作為一項單中心調(diào)查，發(fā)現(xiàn)的普遍性可能有限?？紤]到飲食和運動等因素，多中心方法可以提供更全面的解讀。

最后，多種組學方法的整合（包括培養(yǎng)組學、元轉錄組學和代謝組學），可以提供對微生物群落功能的全面了解。這種更廣泛的視角對于闡明陰道微生態(tài)系統(tǒng)內(nèi)復雜的網(wǎng)絡和陰道微環(huán)境的潛在變化至關重要。

陰道微生物生態(tài)失調(diào)是慢性子宮內(nèi)膜炎的重要指標。該研究確定了與慢性子宮內(nèi)膜炎發(fā)展相關的潛在候選細菌，并提出了潛在的機制。基于陰道微生物群的生物標志物有望成為檢測慢性子宮內(nèi)膜炎的非侵入性工具。需要進一步的研究來發(fā)現(xiàn)特定陰道微生物組在慢性子宮內(nèi)膜炎中的功能，并確定具有診斷能力的強大陰道微生物標記物，以區(qū)分患有慢性子宮內(nèi)膜炎的個體。