一、 病原檢測采樣的原則及要點

1、當前病原體檢測的主要方法

1.1 病毒性病原：PCR、RT-PCR、qPCR、qRT-PCR 、LAMP、NASBA

1.2 細菌性病原：接種分離培養(yǎng)、PCR

1.3 寄生蟲病原：鏡檢、PCR

2、檢測項目的選擇

2.1 全身性疫?。贺i瘟、藍耳、圓環(huán)、偽狂、細菌、弓形體、附紅體等；

2.2 呼吸系統病：藍耳、流感、偽狂犬、支原體、細菌等；

2.3 消化系統?。毫餍行愿篂a、傳染性胃腸炎、輪狀病毒、黃白痢、增生性回腸炎、副傷寒、寄生蟲等；

2.4 繁殖障礙?。贺i瘟、藍耳、偽狂、乙腦、細小、衣原體等。

3、采樣一般原則

3.1 先排除、后取樣：背景信息、非傳染病因素、可能的病因；

3.2 盡早采樣：關注疫病的病程，采樣時機合理；

3.2.1 分離時機：現時對很多病原在動物體內的消長規(guī)律還缺乏透徹的了解，尤其是藍耳、流感病毒出現“病毒血癥”的時機相當微妙，如果沒有對發(fā)病動物作及時細致的跟蹤觀察，而只是隨機性抽取血樣，很難捕獲目標。

3.2.2 藥物干擾：臨床經驗表明，對病豬作抗生素、化學藥物處理以及疫苗接種等措施都有可能影響病原分離結果。因此，對臨床樣品處理方法可能應有別于實驗動物。

3.3 采樣種類要齊全：“全”與“準”；

3.4 生物安全：避免因采樣造成疫病擴散，后續(xù)處理得當；

3.5 樣品背景信息要完整：日齡、免疫程序、用藥情況、發(fā)病情況、剖檢情況、拍照。

4、樣品采集

5、采樣時間

5.1 病原檢測采樣：取樣時間要求在病豬死后即行采取,最好不超過2小時。剖開腹腔后,首先取材料,再作檢查。

5.2 注意事項：腸道樣品需在腸管兩端進行打結，且需單獨保存；關節(jié)樣品、皮膚、肌肉等樣品，可送檢整個組織或部分機體；細菌類樣品，盡量抗生物治療前取樣，避免冷凍，應保持冷藏溫度（2-8℃）盡快送檢。

6、采樣部位

7、采樣準備

7.1 動物剖檢工具：手術刀(刀片、刀柄)、手術鋸、骨剪；

7.2 樣品采集工具：注射器、載玻片、無菌棉拭子、手術剪、止血鉗、無齒鑷；

7.3 樣品收集工具：離心管、(注射器)、標本袋(自封袋)、病理固定袋；

7.4 防護工具：手套、口罩、帽子、防護服；

7.5 其他：冰袋、冷藏箱、記號筆、鉛筆等。

8、豬鼻拭子樣品采集：用于病原分離及分子生物學檢測；

9、積液樣品的采集：包括胸腔積液、心包積液、腦積液、關節(jié)液等；

10、血涂片的制作

11、病理組織學檢測樣品采集

11.1 樣品選擇：處于急性發(fā)病期、新鮮組織樣品；

11.2 取樣部位：正常組織與病變組織交界處；

11.3 采樣要求：避免造成人為的損傷(來回鋸拉組織、鑷子捏壓取樣部位）；

11.4 取樣大小：1*1*0.5cm(腦為徑向切開、一半進行固定);

11.5 處理要求：廣口固定容器，10%福爾馬林溶液（4%的甲醛溶液）固定，組織與固定液比例1：10~20為宜，常溫固定，固定前后均不可冷凍；如用作冰凍切片，則需將組織塊放在0~4℃容器中，盡快送達實驗室。

12、抗凝血樣品的采集

二、抗體檢測采樣的原則及要點

1、采樣前要考慮的幾個方面

1.1 采樣目的：免疫評估、風險預警、疫病輔助診斷；計劃所采樣品能否解決采樣目的。

1.2 采樣方法：科學、規(guī)范；

1.3 采樣時機：及時、準時、規(guī)律性；

1.4 檢測方法：檢測方法對樣品的要求，樣品種類、量、狀態(tài)等；

1.5 生物安全：人員防護、防止問題擴大、重要疫病排除；

1.6 樣品信息：詢問編號、免疫、用藥、臨床情；

1.7 其他方面：包裝、運輸、樣品保存條件等。

2、樣品背景信息收集

2.1 免疫程序：免疫日齡、疫苗種類、廠家、免疫方式；

2.2 臨床用藥：藥物種類，廠家、使用量、用藥途徑；

2.3 發(fā)病情況：發(fā)病特點、日齡、典型臨床癥狀、發(fā)病率、死亡率；

2.4 病理變化：各組織臟器的大體解剖病理變化；

2.5 現場觀察：動物外觀、大群、飲食、呼吸、環(huán)境、氣味；

2.6 記錄：筆記、檔案、照片。

3、采樣時間

3.1 免疫抗體：疫苗免疫后3－4周以上；

3.2 母源抗體：CSFV抗體20-50日齡，偽狂犬抗體35-70日齡；

3.3 野毒抗體：發(fā)病康復后2周以上。

4、采樣數量：樣品采集量取決于本次檢測的目的、內容、被檢豬群健康狀況等。

5、血清樣本量的計算公式：n=[1-(1-a)1/D]×[N-(D-1)/2]

6、血清樣本的數量：多數情況下，根據以往的實踐和統計學經驗，20－30以上的樣本被認為是合理的（介于29和19份之間），在檢測10-15%的流行的疾病時獲得95%的可信度。

7、豬血液樣品采集

7.1 前腔靜脈采血：適用于各階段的豬，采血量不限，可能損害迷走神經。（右側迷走神經較少）

7.2 耳靜脈采血：成年豬（經產母豬），采血量1-2ml，使用注射器或刀片；易形成血腫，血樣易污染。

8、血清樣本的制備

8.1 血清：血液流出血管后不經抗凝處理，會很快凝成血塊，隨著血塊逐漸縮緊會析出淡黃色的清亮液體，稱為血清。

8.2 析出血清：采血完畢后，（一般3ml血液足夠用于抗體檢測）將注射器拉至最大刻度，室溫下平放靜止析出血清?；蛑糜?7℃溫箱中1h后置2-8℃中1h，析出血清。

8.3 不符合要求的血清：溶血、膠凍樣、渾濁等。

三、樣品的保存、包裝、運輸

1、樣品的包裝

2、運輸注意事項：如果樣品能在采集后24h內送抵實驗室，則可放在加冰袋的（4℃左右）保溫容器中運送。在24h內不能將樣品送往實驗室，組織或已離心出血清的情況下，需將樣品冷凍，裝在保溫箱內加冰袋維持低溫狀態(tài)運送。如需寄送，裝箱時要墊上足夠緩沖材料。甲醛固定的組織樣品，需在常溫條件下充分固定，不能冷凍，以防止組織形態(tài)改變。

3、樣品的運輸

3.1 要求：低溫，快速、信息明確、提前溝通。

3.2 注意事項：

3.2.2 建議順豐快遞/大巴車；

3.2.3 確保過程低溫，保證樣品的可用性；

3.2.4 不宜運輸死亡動物尸體。