背景與歷史

• 啟動時間：1990年，目標是繪制完整的人類基因組序列。
• 完成情況：2003年完成了85%的基因組序列，2022年完成了所有缺失片段的填補。
• 歷時：32年完成了完整的人類基因組測序。
• 技術對比：最初使用的是Sanger測序技術，一次只能測序一條DNA鏈。而NGS技術可以同時測序數(shù)十億條DNA鏈，大大提高了速度。
  NGS的誕生與發(fā)展：
• 通過NGS技術，測序一個人的全基因組只需一天，顯著縮短了測序時間。
• NGS技術依賴于人類基因組計劃創(chuàng)建的參考基因組。

NGS的原理與步驟

樣品處理

• 樣品收集：收集目標DNA或RNA樣本。
• DNA/RNA純化：提取并純化樣品，確保樣本純凈且無降解。

• RNA逆轉錄：如果目標樣品為RNA，需通過逆轉錄將RNA轉化為cDNA（互補DNA），才能進行后續(xù)的DNA測序。

  
  

  

文庫構建

• DNA片段化：
• 使用高頻聲波或酶將長鏈DNA切割成短片段。
• 片段的長度根據(jù)應用需求進行特定控制。
• 添加適配子（Adapters）：
• 適配子是添加到每個DNA片段兩端的短DNA序列。
• 這些適配子包含了測序儀器所需的序列信息，還包含樣品標識（Index），用于區(qū)分不同的樣本。
• 文庫純化與擴增：
• 通過磁珠等方法去除未結合的適配子，保證文庫的質量。
• 根據(jù)具體應用，可能加入PCR擴增步驟來增加文庫的量。
• 一個成功的文庫需達到指定的片段長度和足夠的濃度，才能進入下一步測序。

測序準備與合成

• 流動池表面準備：
• 測序發(fā)生在玻璃表面的流動池（Flow Cell）中，流動池表面附有與文庫適配子序列匹配的寡核苷酸（Oligonucleotides）。
• 文庫加樣與變性：
• 將文庫片段通過變性（Denaturation）處理，轉變?yōu)閱捂淒NA。
• 單鏈DNA與流動池表面的寡核苷酸結合，形成DNA鏈。
• 克隆擴增（Clonal Amplification）：
• 使用PCR技術對文庫片段進行擴增，以便形成簇（Cluster），增加熒光信號的強度。
• 過程：DNA鏈通過橋式PCR擴增，形成多個拷貝（雙鏈DNA），然后將雙鏈分離，重復此過程形成大量局部簇。最終切割掉反向鏈，留下前向鏈用于測序。

測序過程

• 測序合成（Sequencing by Synthesis, SBS）：
• 原理：測序時通過DNA聚合酶將熒光標記的核苷酸（A、T、G、C）依次加入待測DNA鏈中，每次加入一個堿基，熒光信號被相機捕獲和記錄。
• 每種堿基（A、T、G、C）帶有不同顏色的熒光標簽和終止子，確保每個循環(huán)只能加入一個堿基。
• 測序步驟：
1. 加入帶熒光標簽的核苷酸，堿基配對。
2. 相機記錄每個簇的熒光信號（顏色）。
3. 去除終止子，繼續(xù)加入下一個核苷酸，重復此過程，直到完成預設的測序長度。
• 指數(shù)讀取：
• 指數(shù)（Index）測序：通過標識序列區(qū)分不同的樣本。
• 多重樣本測序：利用獨特的雙重指數(shù)標簽，最高可同時在一個流動池中處理384個樣本。
• 雙端測序（Paired-End Sequencing）：
• 雙端測序生成兩個來自同一片段的讀取（一個來自前向鏈，一個來自反向鏈），增加了測序的準確性，尤其是長片段分析。
• 過程：前向鏈測序完成后，創(chuàng)建橋接結構使反向鏈成為模板，接著對反向鏈進行測序。

數(shù)據(jù)處理

• 質量控制與過濾：
• 在測序完成后，過濾掉質量較差的讀取，如重疊的簇、強度過低的簇，以及多重簇的情況。
• 去重與解復用（Demultiplexing）：
• 利用樣本指數(shù)（Index）將不同樣本的讀取分離。
• 比對與組裝：
• 將過濾后的讀取比對到參考基因組上，重組DNA片段，并通過算法識別和定位這些片段。
• 深度與覆蓋度：
• 讀數(shù)深度（Read Depth）：指某個核苷酸被測序的次數(shù)。常規(guī)全基因組測序需要30倍的平均讀數(shù)深度，癌癥研究中檢測稀有突變時需要更高的讀數(shù)深度（如1500倍）。
• 覆蓋度（Coverage）：目標是確保測序過程中目標區(qū)域沒有遺漏，覆蓋率越高，數(shù)據(jù)越完整。

參考文獻