目的：研究施用生物炭和菌劑對溫室土壤磷、鉀有效性、番茄生長及細菌群落的作用。

材料與方法：試驗于2018年11月至2019年6月在河北省永清縣日光溫室內(nèi)進行，番茄單作21年。處理包括常規(guī)施肥對照（CF）、生物炭施用量2 t/ha（B，杏殼制）、微生物菌劑施用量75 L/ha（M，含有Bacillus megaterium和Paenibacillus mucilaginosus的有效菌株）、微生物菌劑與生物炭的混合施用（BM）。

結果：溫室番茄施用75 L/ha菌劑，產(chǎn)量提高23.41%，Vc和可溶性糖含量分別提高14.41%和13.62%。微生物菌劑與2 t/ha生物炭復合處理，可提高微生物菌劑對番茄的促生效果。在番茄全生育期內(nèi)，微生物菌劑與生物炭配合施用可使番茄植株磷、鉀積累量分別提高28.72-57.14%和19.53- 29.03%。此外，微生物接種劑的應用顯著增加了芽孢桿菌，類芽孢桿菌和黃桿菌的相對豐度，并降低了酸桿菌的相對豐度。

結論：微生物菌劑的施用通過改變土壤細菌群落組成，提高了磷、鉀的生物有效性，促進了番茄生長。這些結果表明，生物炭和微生物接種劑作為一種潛在的工具，以維持長期生產(chǎn)的溫室單作蔬菜系統(tǒng)的共同應用的潛力。

番茄（Lycopersicon esculentum）是茄科一年生或多年生草本植物，是世界上最受歡迎的蔬菜之一，其果實富含番茄紅素、酚類、有機酸、維生素和許多其他有益成分（Cochard et al. 2022; Yagmur and Gunes 2021）。在中國，通常采用溫室條件下連續(xù)單作番茄以獲得更好的經(jīng)濟效益（Zheng等人，2020）。然而，在常規(guī)管理實踐中，溫室番茄長期連續(xù)單一栽培可能會對土壤質(zhì)量產(chǎn)生負面影響，導致植物生長和果實品質(zhì)不良，以及病蟲害加?。?/span>Hongdan et al，2017; Zhao et al，2019a）。因此，制定可持續(xù)、高效的管理策略，改善設施蔬菜生產(chǎn)系統(tǒng)的土壤質(zhì)量，促進土壤健康發(fā)展，實現(xiàn)蔬菜生產(chǎn)的長期可持續(xù)發(fā)展，已成為當務之急。

近年來，微生物技術因其高效、環(huán)保等特點，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和環(huán)境保護領域引起了極大關注（Singh et al.2021）。近年來，越來越多的功能微生物被鑒定出來。例如，研究表明Bacillus megaterium能夠分泌有機酸溶解磷酸鹽，在其基因序列中發(fā)現(xiàn)了與檸檬酸合酶合成相關的基因（Huang et al. 2019）。Gupta和Kumar（2017）表明，細菌不僅可以通過分泌有機酸溶解磷酸鹽，還可以利用自身的官能團螯合土壤中的金屬離子，進一步促進磷酸鹽的釋放。細菌分泌胞外酶，在土壤中有機磷的礦化中發(fā)揮積極作用（Raliya等人，2016年）。同時， Paenibacillus mucilaginosus以溶解鉀而聞名。研究表明，硅酸鹽細菌的代謝可以產(chǎn)生酶、莢膜多糖和低分子有機酸，破壞鉀長石的晶格結構，將土壤礦物鉀和固定化鉀分解轉(zhuǎn)化為可被植物吸收利用的有效鉀（Sindhu et al. 2014）。Paenibacillus mucilaginosus分泌莢膜多糖，這是一種典型的特征性溶鉀細菌（Huang et al. 2019）。然而，這些功能菌發(fā)揮作用的關鍵和難點是確保它們能在土壤中長時間良好停留。

生物炭是一種改善土壤性質(zhì)的潛在改良劑，由于其良好的研究效益，如改善土壤肥力和結構，促進農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的植物生長，被用作土壤改良劑（Singh et al. 2022; Zhu et al. 2017）。然而，以前關于生物炭應用的研究主要集中在其作為土壤改良劑/調(diào)理劑來改變土壤物理和化學性質(zhì)，很少考慮其對土壤生物性質(zhì)的影響，特別是短期應用（Paz-Ferreiro et al，2015）。此外，生物炭富含營養(yǎng)物質(zhì)，其特征在于表面積上的高孔隙率，這可能為細菌增殖和存活提供了有利的棲息地（Glodowska et al，2017）。據(jù)報道，通過緩慢熱解農(nóng)業(yè)廢物產(chǎn)生的生物炭顯著增加了伯克霍爾德氏菌和芽孢桿菌的存活率，并刺激了種子萌發(fā)、植物生長和番茄產(chǎn)量以及土壤生物活性（Tripti et al，2017）。眾所周知，“并非所有生物炭都是一樣的”，因此，對作物的影響既有生物炭的特異性，也有地點的特異性（Mukherjee and Lal，2014）。要更好地理解這些關系的復雜性，需要更多的實地研究。

因此，我們推測：（1）生物炭的孔隙結構為直接施用的微生物菌劑提供了附著位點，從而提高了土壤微生物活性;（2）微生物菌劑與生物炭的聯(lián)合施用有助于促進菌株的養(yǎng)分活化和作物生長功能。為了驗證我們的假設，進行了一個溫室實驗，以確定：（1）生物炭與含Bacillus megaterium 和 Paenibacillus mucilaginosus有效菌株的微生物菌劑配施對土壤磷、鉀有效性的影響，和番茄生長發(fā)育的關系;（2）土壤細菌群落的多樣性和組成對復合污染的響應。生物炭和微生物菌劑的應用。本文的研究成果將為集約化溫室蔬菜生產(chǎn)高效環(huán)保調(diào)控技術的發(fā)展提供新的思路。

試驗地點為河北省廊坊市永清縣（39°09′01″N，116°33′14″E），連續(xù)21年溫室栽培普羅旺斯番茄。按照標準程序（Abou-El-Seoud和Abdel-Megeed，2012年）測量了關鍵的土壤特性。土壤的pH值（H₂O）為8.4，有機質(zhì)含量為18.3 g/kg。全氮1.2g/ kg，堿解氮122.3mg/kg，速效磷257.4mg/kg，速效鉀1171.6mg/kg。氣候?qū)俚湫偷臏貛Т箨懶约撅L氣候，年平均氣溫約11.5 ℃，年平均降水量約540 mm，年平均日照2740 h，無霜期183天。

Bacillus megaterium和Paenibacillus mucilaginosus的有效微生物菌劑由河北潤沃生物科技公司提供，菌數(shù)為2 × 10⁸ cfu/mL，兩者有效菌數(shù)比為1：1。生物炭由承德華晶活性炭有限公司提供，以杏殼為原料，在800-900 ℃下反應0.5 h，制得的生物炭有機碳含量為73.1%，總氮含量為9.4 g/kg，總磷含量為11.3 mg/kg，總鉀含量為10.6 mg/kg，pH值為9.6。

設置了四種處理：不施用生物炭或微生物接種劑對照的常規(guī)施肥（CF）、用2噸/公頃生物炭的常規(guī)施肥（B）、用75升/公頃微生物接種劑的常規(guī)施肥（M）、用75升/公頃微生物接種劑和2噸/公頃生物炭的混合物的常規(guī)施肥（BM）。每種處理重復3次。試驗共設12個樣地，每個樣地為8.4m × 3.6m（長×寬）。移栽前一周，根據(jù)當?shù)厥卟朔N植者的常規(guī)做法旋耕土壤。移栽前一天，隨機布置試驗小區(qū)。常規(guī)施肥的全量養(yǎng)分施用量為N 424 kg/ha、P₂O₅ 332 kg/ha、K₂O 707 kg/ha。

分別在初果期（移栽后20 d）、盛果期（移栽后60 d）、末果期（移栽后100 d）和末果期（移栽后140 d）采集土壤樣品。在距番茄主根10-15 cm處取0-20 cm的表土。從每個地塊隨機抽取5個土壤樣品，充分混合，其中一部分儲存在-80 ℃冰箱中，用于土壤微生物多樣性測定。將剩余的土壤樣品風干并過篩，以測定土壤肥力。

土壤有效磷濃度采用碳酸氫鈉浸提法和抗鉬銻比色法測定，土壤有效鉀濃度采用醋酸銨浸提法和火焰光度法測定（Abou-El-Seoud and Abdel-Megeed 2012）。

按照制造商的程序（E. Z. N. A. ?土壤DNA試劑盒）從0.5g凍土樣品中提取DNA，隨后通過Miseq測序（上海邁喬生物生物技術有限公司）進行測序以研究微生物多樣性。擴增區(qū)域為細菌16S rRNA的V3-V4區(qū)，所用引物為：F: 515F (GTG CCA GCMGCC GCG G) 和R: 907R (CCG TCA ATTCMTTT RAG TTT) (Yusoff et al.2013)PCR溫度曲線如下：95 ℃變性3 min，95 ℃變性3s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，27個循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min。PCR反應在20 μL含有4 μL 5 × FastPfu緩沖液，2 μL 2.5mmol/L dNTPs，0.8 μL各引物（5 μM）、0.4 μL FastPfu聚合酶和10 ng模板DNA。擴增后，進行純化和熒光定量，并在Illumina MiSeq平臺上進行測序。

在番茄移栽后20、60、100、140d采集植株樣品，每個小區(qū)隨機抽取5株，60 ℃烘干至恒重，用于植株組織營養(yǎng)成分分析。在盛果期采集外觀和大小相似的成熟果實，每個小區(qū)隨機采集5個果實作為樣品，主要測定硝酸鹽、維生素C（Vc）、可溶性蛋白質(zhì)和可溶性糖含量。此外，還記錄了每個小區(qū)的番茄產(chǎn)量。

對番茄果實的品質(zhì)，采用紫外分光光度法測定硝酸鹽含量，鉬藍比色法測定Vc含量，考馬斯亮藍G-250染色法測定可溶性蛋白含量，濃硫酸-蒽酮比色法測定可溶性糖含量。按照先前描述的方法（Zhao et al. 2021）測定番茄組織營養(yǎng)素并計算番茄植物中的P和K累積量。

在Mothur中計算了Shannon、Sobs、Chao 1和覆蓋率的多樣性指數(shù)，并用于比較不同處理之間的土壤細菌α多樣性。利用SPSS軟件（Version 22.0），基于Tukey's post-hoc檢驗，采用單因素方差分析（one-way ANOVA）對番茄產(chǎn)量和品質(zhì)、植株組織干重、植株組織中磷和鉀積累量、細菌α多樣性以及不同分類水平細菌相對豐度的顯著差異進行分析。

與常規(guī)施肥相比，M和BM處理的番茄產(chǎn)量分別提高了28.27%和23.41%（p < 0.05）（圖1）。BM處理比M處理增產(chǎn)3.09%（p < 0.05）。但B處理與CF處理的番茄產(chǎn)量差異不顯著。結果表明，在溫室大棚內(nèi)施用75 L/ha菌劑可顯著提高番茄產(chǎn)量，施用2 t/ha生物炭可增強菌劑對番茄的增產(chǎn)效果。

與CF相比，M處理顯著提高了Vc含量14.41%，BM和M處理分別顯著提高了可溶性糖含量13.27%和13.62%（p < 0.05）（表1）。不同處理對番茄果實硝酸鹽和可溶性蛋白質(zhì)含量的影響無顯著差異。結果表明，施用微生物菌劑可提高番茄果實的品質(zhì)。

植株生物量是番茄生長發(fā)育的重要指標。在苗期，M和BM處理的番茄根干重比CF處理顯著增加29.79%和65.95%。結果初期，M和BM處理使番茄地上部干重分別增加14.66%和17.86%，根系干重分別增加21.77%和33.04%。同樣，M和BM處理也分別增加了盛果期和末果期番茄地上部和根系的干重。B處理和CF處理的番茄地上部和地下部干重在后3個生育期差異不顯著。結果初期和盛果期，BM處理的地上部和地下部干重分別比M處理增加4.42-6.62%和8.73- 12.88%，差異顯著（p < 0.05）。結果表明，施用75 L/hm 2的微生物菌劑可促進番茄不同生育期的生長發(fā)育，施用2 t/hm ²的生物炭可增強微生物菌劑對番茄的促生效果。

結果表明，與對照相比，BM處理顯著提高了土壤速效磷含量，盛果期和末果期分別提高了24.10%和30.02%，速效鉀提高了37.22%和4.33%（p < 0.05）。但在苗期和結果初期，BM和CF處理土壤速效P和速效K差異不顯著。說明微生物菌劑與生物炭配施對溫室番茄土壤磷、鉀的活化具有“后效”作用。

此外，番茄植株組織中的P和K積累量在不同處理之間也存在差異（p < 0.05）（表4）。在整個生育期內(nèi)，與CF相比，M和BM處理顯著提高了番茄植株中磷的含量，分別提高了17.47-32.52%和28.72-57.14%。B處理僅在盛果期增加了P的含量。與M處理相比，BM處理番茄植株中的磷含量也增加了9.03- 22.22%。在整個生育期內(nèi)，M和BM處理番茄植株體內(nèi)的鉀素含量比CF處理顯著提高了12.60-16.89%和19.53-29.03%。與常規(guī)施肥相比，B處理在番茄生長的最后3個時期，番茄植株體內(nèi)的鉀含量分別增加了1.63-4.21%。與M處理相比，BM處理在番茄生長的最后三個時期也增加了植株體內(nèi)的鉀含量。說明微生物菌劑能顯著促進番茄植株對磷、鉀養(yǎng)分的吸收，微生物菌劑與生物炭配合使用有利于增強微生物菌劑的效果。

對4個處理的48個番茄不同生育期土壤樣品16S rRNA的V3和V4區(qū)進行了序列測定。測序數(shù)據(jù)包括2，090，771個有效序列，828，908，015個堿基，序列的平均長度為396.46 bp，具有40，921個OTU，相似水平為97%（表5）。結果表明，在結果初期，M處理和BM處理的土壤細菌群落結構指數(shù)差異顯著（p < 0.05），而其他處理之間差異不顯著，表明施用微生物菌劑不會對土壤細菌群落多樣性產(chǎn)生不利影響。

圖2為溫室番茄不同時期不同處理土壤細菌群落的門組成及分布。優(yōu)勢門（相對豐度> 1%）的有Pro-teobacteria，Actinobacteria，Acidobacteria，Bacteroidetes，Chloroflexi，Firmicutes，Planctomycetes，Gemmatimona-detes，和Nitrospirae，占總序列的89.76%~ 95.88%，相對豐度分別為26.03%~ 35.07%、12.50%~ 19.32%、11.01%~ 17.17%，分別為5.77至19.10%、6.50至10.39%、4.32至11.60%、6.28至8.26%、2.79至4.59%和1.20至2.13%。結果表明，不同處理和番茄不同生育期的土壤細菌種類組成基本一致，但苗期和盛果期土壤中酸桿菌的相對豐度差異顯著（p <0. 05）。與對照相比，M處理的酸性細菌相對豐度在苗期和盛果期分別降低了25.52%和42.61%。同時，在盛果期，M處理的Acidobacteria相對豐度比B處理降低了42.19% Acidobacteria屬于寡營養(yǎng)菌，其相對豐度會隨著速效養(yǎng)分濃度的增加而降低。結果表明，番茄移栽期施用75 L/ha菌劑可改善土壤細菌群落結構，促進土壤磷、鉀的活化，導致土壤中酸性細菌相對豐度降低。

優(yōu)勢菌屬的相對豐度顯示出與相應細菌門相似的模式（圖3）。在苗期，與對照相比，BM處理的芽孢桿菌相對豐度提高了63.23%，M和BM處理的類芽孢桿菌相對豐度分別提高了268.42%和194.74%，B、M和BM處理的黃桿菌相對豐度分別提高了268.42%、194.74%和94.74%。有趣的是，與CF相比，BM處理中酸桿菌的相對豐度降低了41.12%。結果表明，與對照相比，M處理和BM處理的芽孢桿菌相對豐度分別提高了77.20%和87.09%，BM處理的類芽孢桿菌相對豐度提高了161.54%，而BM處理的酸桿菌相對豐度降低了33.58%。在盛果期，與對照相比，BM處理的芽孢桿菌相對豐度增加了178.45%，類芽孢桿菌相對豐度B、M、BM處理分別增加了41.67%、17.65%、17.65%;

而BM處理的酸桿菌相對豐度下降了55.99%。結果末期，與對照相比，M和BM處理的芽孢桿菌相對豐度分別提高了36.26%和27.25%，類芽孢桿菌相對豐度分別提高了106.67%和93.33%，而酸桿菌相對豐度則降低了29.26%。施用75 L/ha菌劑后，溫室土壤中芽孢桿菌、類芽孢桿菌和黃桿菌的相對豐度顯著增加（p < 0.05），而酸桿菌的相對豐度顯著降低（p < 0.05）。從初結果期到盛果期，芽孢桿菌和類芽孢桿菌的相對豐度顯著增加，而酸桿菌的相對豐度顯著降低。結果表明，施用微生物菌劑不僅可以增加土壤中解磷、解鉀功能菌的相對豐度，還可以增加土壤中植物生長素分泌功能菌的相對豐度，促進番茄生長。

結果表明，施用75 L/hm 2菌劑能顯著增加番茄根、莖干重，提高番茄產(chǎn)量、Vc含量和可溶性糖含量。結果表明，施用含有Bacillus megaterium和Paenibacillus mucilaginosus的微生物菌劑能促進番茄生長，改善番茄品質(zhì)。研究表明，Paenibacillus mucilaginosus處理的番茄種子發(fā)芽快，發(fā)芽率高，能促進番茄幼苗根長的增長，增加植株鮮重、干重和根冠比（Li et al. 2017，Nuzzo et al. 2020）。我們之前的研究也證明了Bacillus megaterium的應用顯著增加了不同溫室條件下辣椒和黃瓜的生長（Zhao et al，2021，2019 b）。微生物菌劑與生物炭配合施用比單獨施用能顯著提高番茄的生長和品質(zhì)。可能是由于生物炭的高表面積和吸附營養(yǎng)物質(zhì)的能力，它為微生物提供了一個非常有利的棲息地，以進行殖民，生長和繁殖（Semida et al. 2019）。生活在里面的微生物可以得到更好的保護，免受外部因素的影響，如干燥，不利的pH值或土壤中的有毒物質(zhì)。據(jù)報道，微生物菌劑和生物炭聯(lián)合施用可提高番茄植株和果實中的總鉀濃度，提高番茄產(chǎn)量和Vc濃度，降低硝酸鹽濃度（Wang et al. 2016b）。結果表明，生物炭與微生物菌劑配合使用可提高微生物菌劑的促生長效果。

結果表明，生物質(zhì)炭與微生物菌劑配施可顯著提高土壤速效P、K含量，促進番茄植株對P、K養(yǎng)分的吸收，從而促進番茄生長。生物炭的特點是表面積上的高孔隙率，這可能為水和微生物的增殖提供額外的孔隙空間（Glodowska et al.2017）。生活在孔隙內(nèi)的微生物可能會得到更好的保護，免受外部因素的影響，如干燥，不利的pH值或土壤中的有毒物質(zhì)（Chen et al.，2013）。研究發(fā)現(xiàn)，Paenibacillus mucilaginosus可以分解硅酸鹽礦物，釋放出P和K（Lv et al.，2020）。Paenibacillus mucilaginosus產(chǎn)生的胞外多糖也可以增強植物的非特異性免疫力（Chang et al. 2014）。Paenibacillus mucilaginosus的鉀溶解與其多糖、氨基酸和有機酸的分泌有關（Xi et al，2009）。將Bacillus megaterium接種在卵黃培養(yǎng)基上，發(fā)現(xiàn)其溶磷圈明顯，表明其具有溶解有機磷的功能（Korir et al. 2017; Zhou et al. 2016）。Bacillus megaterium對有機磷和無機磷也有很強的降解能力，溶磷的機理由菌株生長過程中的代謝產(chǎn)物決定。金屬離子包括有機酸、質(zhì)子和多糖，其中有機酸可以螯合不溶性磷酸鹽使其溶解;質(zhì)子可以通過降低周圍環(huán)境的pH值來溶解不溶性磷酸鹽;而多糖可以通過羥基和羧基與有機酸的協(xié)同作用來加速不溶性磷酸鹽的溶解(Munjal et al. 2016; Rocha et al. 2017;Wu et al. 2012)。通常，生物炭可以被認為是微生物接種劑的合適載體或制劑。

土壤細菌群落的多樣性和組成是反映土壤生物肥力的重要指標。通過高通量測序，發(fā)現(xiàn)變形菌門、酸菌門、擬桿菌門、放線菌門、芽單胞菌門、綠彎菌門和厚壁菌門是所有土壤樣品中的優(yōu)勢細菌門。變形菌是一種富營養(yǎng)細菌，通常出現(xiàn)在營養(yǎng)豐富、含碳量高的土壤中（Zhang et al. 2019）。微生物菌劑與生物炭的聯(lián)合施用沒有影響土壤細菌群落的多樣性，但顯著增加了有益細菌屬芽孢桿菌屬、類芽孢桿菌屬和黃桿菌屬的相對豐度（圖3）。研究表明，芽孢桿菌屬、類芽孢桿菌屬和黃桿菌屬不僅可以溶解磷和鉀以供植物吸收，還可以產(chǎn)生生長素，生長素可以刺激植物生長發(fā)育(Rocha et al. 2017; Tsukanova et al. 2017;Wang et al. 2016a).。這表明生物炭和微生物菌劑配合施用促進番茄生長的作用可能是通過刺激土壤中原生有益菌的生長來實現(xiàn)的。此外，生物質(zhì)炭與微生物菌劑的配施還可通過增溶土壤磷、鉀和促進有益微生物類群的生長，促進土壤的健康發(fā)育。

75 L/ha的菌劑施用促進了番茄植株的生長，提高了土壤磷、鉀的生物有效性，從而提高了番茄產(chǎn)量;菌劑與2 t/ha的生物炭配合施用進一步增強了菌劑的促生作用，產(chǎn)生了協(xié)同效應。施用微生物菌劑對土壤細菌群落的多樣性沒有影響，但增加了芽孢桿菌屬、類芽孢桿菌屬和黃桿菌屬的相對豐度，降低了酸桿菌屬的相對豐度。微生物接種劑與生物炭的聯(lián)合應用有可能成為一種有效的管理工具，以提高土壤肥力和健康，并在溫室條件下維持番茄的長期生產(chǎn)。